Пухлини. Популяції пухлинних клітин

2. Пухлина Вільмса  (нефробластома) — злоякісне новоутворення  нирки, яке розвивається головним  чином у дітей. У багатьох  випадках визначається делеція  частини 11 хромосоми. І спорадичні, і родинні випадки мають механізм, який подібний до механізму при ретинобластомі. І також порушення в 11 хромосомі (11p13) ідентифікуються при інших типах пухлин. WT-1 є геном супресії пухлини.

3. Інші успадковані  новоутворення — деякі інші  новоутворення також мають спадкову  схильність. Раніше вважали, що вони успадковуються за домінантним типом, але це було переоцінено після відкриття рецесивних генів супресії пухлин.

Нейрофіброматоз (1 тип хвороби вон Реклінгхаузена) — ця пухлина характеризується розвитком  множинних нейрофібром і пігментованих плям неправильної форми на шкірі (кольору «кава з молоком»). При нейрофіброматозі, NF-1 ген (хромосома 17q11) або відсутній, або має порушену структуру, що призведе до втрати NF-1 супресорного білка. NF-1 білок, як припускається, регулює активність похідних (гуанін-зв’язуючі “G” білки) ras прото-онкогена. При втраті NF-1 ріст-активуючий ефект G білків нічим не компенсується.

 Множинний  ендокринний аденоматоз — це  захворювання виявляється доброякісними  новоутвореннями в щитовидній, паращитовидних  залозах, гіпофізі та мозковій речовині надниркових залоз.

Родинний поліпоз  кишки — поліпоз кишки характеризується численними аденоматозними поліпами в  кишці. (Є втрата гетерозиготності на довгому плечі 5 хромосоми, APC гена). В остаточному підсумку розвивається рак кишки у всіх пацієнтів, яким не виконується колонектомія. Дане захворювання є наочним доказом теорії численних поштовхів, які послідовно призводять до виникнення злоякісного новоутворення. Синдром Гарднеру — варіант, при якому кишкові поліпи поєднуються з доброякісними новоутвореннями та кістами в кістках, м’яких тканинах і шкірі. Синдром Туркоту, дуже рідкісна хвороба, при якій численні аденоматозні поліпи кишки поєднуються із злоякісними пухлинами (гліомами) симпатичної нервової системи.

Синдром невоїдного базальноклітинного раку — це порушення характеризується диспластичними меланоцитарними невусами і базальноклітинним раком шкіри.

Б. Новоутворення  з полігенетичним успадкуванням: багато поширених новоутворень є родинними  в меншому ступені — тобто, вони виникають у споріднених осіб частіше, ніж у популяції взагалі.

1. Рак молочної  залози — родичі (матері, сестри, дочки) жінок, які захворіли  на рак молочної залози в  пременопаузному періоді, мають  підвищений ризик виникнення  раку молочної залози (в п’ять  разів вищий, ніж у загальній популяції).

2. Рак кишки  — рак кишки в основному  спостерігається в сім’ях зі  спадковим родинним поліпозом  кишки.

 

8.ТЕОРІЇ РОЗВИТКУ ПУХЛИН

 

На сьогодні існують дві основних теорії виникнення новоутворення — це теорія моноклонального походження та теорія «пухлинного поля».

Згідно теорії моноклонального походження, початковий канцерогенний агент (чинник, який викликає пухлину) спричиняє мутацію поодинокої клітини, при діленні якої після  цього виникає пухлинний клон, що складає новоутворення. Моноклональне походження новоутворення було доведене на прикладі пухлин з B-лімфоцитів (B-клітинні лімфоми і плазмоклітинні мієломи), клітини яких синтезують імуноглобуліни одного класу, а також на деяких інших типах пухлин. Доведено також, що по мірі прогресування пухлини з початкового клону пухлинних клітин можуть розвиватися субклони в результаті додаткових триваючих генетичних змін («багаторазові поштовхи»; див. нижче).

Теорія «пухлинного  поля»: канцерогенний агент, впливаючи  на велику кількість подібних клітин, може викликати утворення поля потенційно неопластичних клітин. Новоутворення може після цього розвинутися в результаті розмноження однієї або великої кількості клітин всередині цього поля. У багатьох випадках в результаті виникає декілька відокремлених новоутворень, кожне з яких походить від окремого клонального попередника. Утворення пухлинного поля може бути розцінене як перший з двох чи більше послідовних етапів, які ведуть до розвитку пухлини (“багаторазові поштовхи”; див. нижче). Ця теорія пояснює походження деяких новоутворень у шкірі, епітелії сечовивідних шляхів, печінці, молочній залозі і кишці. Визнання факту існування пухлинного поля має практичне значення, тому що наявність одного новоутворення в будь-якому з цих органів повинно насторожити клініциста у відношенні можливого другого подібного новоутворення. У молочних залозах, наприклад, розвиток раку в одній з них є чинником ризику виникнення раку в протилежній (за статистикою ризик підвищується приблизно в 10 разів у порівнянні з загальною захворюваністю на рак молочної залози).

Для пояснення  механізмів виникнення як пухлинного моноклона, так і “пухлинного  поля” сьогодні запропонований ряд  інших концепцій.

Теорія генетичних мутацій. Порушення в геномі, зумовлені  спадковістю, спонтанними мутаціями або дією зовнішніх агентів, можуть викликати неоплазію, якщо пошкоджуються регулюючі ріст гени. Пухлинна трансформація відбувається у результаті активації (або дерепресії) специфічних послідовностей ДНК, відомих якріст-регулюючі гени, або прото-онкогени. Ці гени кодують ряд чинників росту і рецепторів для чинників росту. Активація — це функціональні зміни, при яких порушується нормальний механізм регулювання росту в онкогенезі. Активація може відбуватися декількома методами: мутація прото-онкогенів; транслокація в більш активну частину генома, де регулюючий вплив активує прото-онкогени; вставка онкогенного вірусу в активну частину генома; ампліфі¬кація (продукування багаторазових копій прото-онкогенів); вставка вірусних онкогенів; дерепресія (втрата супресорного контролю). Виникаючий функціонально активований ген називється «активованим онкогеном» (або мутантним онкогеном, якщо він змінюється структурно), або просто як клітинний онкоген (c-onc). Збільшення продукції стимулюючих чинників росту чи їх рецепторів або зменшення інгібуючих (супресорних) чинників росту, або продукція функціонально патологічних чинників може призвести до неконтрольованого росту клітин. Таким чином на молекулярному рівні неоплазія - це порушення функції регулюючих ріст генів (прото-онкогенів і супресорних генів пухлин).

Теорія вірусних онкогенів. Деякі РНК-віруси містять  послідовності нуклеїнових кислот, які є комплементарними до прото-онкогена і можуть (при дії зворотної  транскриптази) синтезувати вірусну  послідовність ДНК, яка є по суті ідентичною. Ці послідовності названі вірусними онкогенами (v-onc). Багато, можливо всі, онкогенні РНК-ретровіруси містять такі послідовності, і вони знайдені у відповідних новоутвореннях. Сьогодні припускається, що онкогенні РНК-віруси набувають v-onc послідовностей шляхом вставлення клітинного онкогена з клітини тварини або людини за допомогою механізму, подібного до того, який бере участь в рекомбінації. Онкогенні ДНК-віруси також містять послідовності, які функціонують як онкогени і влаштовуються безпосередньо в геном клітини.

Епігенетична  теорія. Згідно епігенетичній теорії, основне клітинне пошкодження відбувається не в генетичному апараті клітини, а в механізмі регулювання  активності генів, особливо в білках, синтез яких кодують ріст-регулюючі гени. Різні рівні активності генів, які відповідальні за диференціювання тканин, як припускається, визначаються успадковуваними епігенетичними механізмами. Основний доказ ролі епігенетичних механізмів у процесах онкогенезу виявляється при утворенні пухлин під впливом деяких хімічних речовин, які не виявляють жодного ефекту на генетичний апарат клітини. Дія деяких з цих речовин полягає у зв’язуванні цитоплазматичних білків, а зміни в них, як припускається, сприяють виникненню деяких новоутворень, тобто ці речовини виступають в роліпромоторів.

Теорія відмови  імунного нагляду. Згідно цій теорії неопластичні зміни досить часто  відбуваються в клітинах організму. В результаті пошкодження ДНК  неопластичні клітини синтезують нові молекули (неоантигени, пухлинні антигени). Імунна система організму розпізнає ці неоантигени як «чужі», що призводить до активації цитотоксичної імунної відповіді, яка знищує неопластичні клітини. Клінічно виявлені новоутворення виникають тільки в тому випадку, якщо вони не розпізнаються і не руйнуються імунною системою. Доказом цієї теорії є те, що велика частота виникнення пухлин спостерігається при імунодефіцитах і у пацієнтів, які отримують імуносупресивну терапію після пересадки органів. Поясненням того, що рак в основному є хворобою літніх людей, може бути те, що в старості спостерігається прогресивне зниження імунної реактивності на тлі збільшення частоти неопластичних змін, які виникають внаслідок дефектів репарації ДНК, що спостерігається при старінні. Проти даної теорії свідчать наступні факти: в мишей з недостатністю Т-клітинного імунітету частота новоутворення не підвищується; у людей з імунодефіцитами розвиваються головним чином лімфоми, а не повний спектр різних пухлин; у людей з видаленим тимусом частота виникнення пухлин не збільшу¬єть¬ся; хоча багато пухлин синтезують пухлинні антигени, й імунна відповідь на них розвивається достатньою мірою, але ця відповідь часто є неефективною.

 

9.Клітинні популяції. Основне

Клітинна  популяція (рис.9.1.) - група однорідних за певним критерієм клітин.

Стабільні (не здатні до оновлення, наприклад, нейрони ссавців).

Популяції, що ростуть (здатні не тільки до оновлення, але  і до зростання, збільшення маси тканини  за рахунок збільшення кількості  клітин та їхньої поліплоїдизації, наприклад, клітини печінки і деяких інших залоз).

Популяції, що оновлюються (характеризуються закономірним оновленням клітин: скільки загинуло, стільки  з'явилося за рахунок поділів  і спеціалізації слабодиференційованих  клітин (напр., клітини кишкового  епітелію, крові).

Відомі інші класифікації клітинних популяцій (напр., функціональні клітинні популяції  гепатоцитів, кардіоміоцитів та ін.).

Рис.9.1.

 

10.Культура клітин

Клітинні культури — це генетично однорідні популяції  клітин, що ростуть у постійних  умовах оточуючого середовища. Це можуть бути штами нормальних клітин людини, тварин, рослин або тканин злоякісних пухлин.

10.1. Умови культивування

Клітини звичайно поміщають у скляні посудини, звідси і дослідження отримали назву  вивчення in vitro (від лат. іn — в, vitro — скло), хоча тепер частіше культури вирощують у пластмасових посудинах. Виділені з тканин клітини інкубують при температурі +38 °C +39 °C (для клітин тваринного і людського організмів) та при +22 °C +28 °C (для рослинних клітин) у живильному середовищі відповідного складу. Клітини тоді ростуть у вигляді суспензії або моношару. Суспензійна культура — це вирощування окремих клітин або невеликих їх груп у завислому стані у рідкому живильному середовищі з використанням апаратури, що забезпечує їх аерацію і перемішування. Характерною особливістю суспензійних культур є їх морфологічна та біохімічна гетерогенність. Клітинна популяція містить клітини, які відрізняються за розміром і формою.

10.2.Застосування

10.2.1.Застосування у цитології

У цитології  даний метод зручний тим, що клітини в культурі легко доступні для різних біохімічних маніпуляцій. При роботі з ними радіоактивні речовини, отрути, гормони та ін. можуть бути введені у потрібній концентрації на протязі необхідного періоду часу. Кількість цих речовин може бути на порядок менше, ніж при експерименті на тварині. Зникає загроза того, що речовина буде метаболізована печінкою, екскретована нирками або відкладеться у м'язах. Це забезпечує отримання реальних значень швидкості дії речовини на клітину або її засвоєння клітиною.

Для дослідження  живих рослинних клітин використовують культуру ізольованих протопластів. Ізольовані протопласти можна визначити  як «голі» клітини рослин, оскільки клітинна стінка видаляється механічним або ферментативним способом. Система ізольованих протопластів дає можливість вести селекцію на клітинному рівні, працювати у малому об'ємі з великою кількістю індивідуальних клітин, отримувати нові форми рослин шляхом прямого перенесення генів, отримувати соматичні гібриди між віддаленими у систематичному відношенні видами. Оскільки в ізольованих протопластах одразу починається регенерація клітинної оболонки, то вони є зручним об'єктом для вивчення формування целюлозних мікрофібрил.

10.2.2.Застосування у вірусології

У вірусології  культури клітин використовуються дуже широко, оскільки з ними порівняно легко працювати у лабораторії, на відміну від інших методів — вирощування вірусів на курячих ембріонах або у організмі живих тварин. Крім того на моношарі клітинної культури можна добре вивчити цитопатичну дію вірусів, за утворенням внутрішньо-клітинних включень, бляшок, у реакціях гемадсорбції й гемаглютинації та за кольоровою пробою. При роботі з культурами клітин суттєві результати можуть бути отримані при роботі з невеликою кількістю культур. Експерименти, які потребують для підтвердження того чи іншого факту сотні або тисячі лабораторних тварин можуть бути з рівною статистичною достовірністю поставлені на такій же кількості культур клітин. Таким чином при лабораторії не треба тримати віварій і відсутні етичні аспекти поводження з хворими тваринами.

Також вивчається трансформація клітин вірусами, механізм якої подібний до механізму виникнення злоякісних пухлин.

10.2.3.Застосування у фармакології

Культури клітин широко застосовуються для тестування дії речовин, які можуть бути використані в якості лікарських препаратів. Попри те, що результати, отримані на культурах клітин не можна екстраполювати на весь організм, не викликає сумніву, що якщо та чи інша речовина порушує діяльність клітин з кількох різних лініях культур, то необхідно очікувати негативного ефекту і при введенні цієї речовини у організм.

10.2.4.Застосування у біотехнології

Специфічні  культури клітин є цінним джерелом гормонів та інших біологічно активних речовин. Вже зараз вони застосовуються для виробництва противірусного білку інтерферону.

10.2.5.Застосування у генетиці

У генетиці здатність  клітин до росту у культурі використовується у наступних напрямках:

• Клонування
• Зберігання клітин
• Отримання мутантних клітин та робота з ними

10.3.Типи культур клітин

10.3.1. Первинно-трипсинізовані — отримують із подрібнених тканин людини та тварин шляхом їх обробки трипсином чи іншими ферментами. Витримують лише 5-10 поділів (пасажів).

10.3.2. Перещеплювані — клітини, які набули здатності до безмежного розмноження, оскільки є похідними пухлин людини та тварин.

10.3.3. Напівперещеплювані (диплоїдні) — можуть витримувати до 100 пасажів, зберігаючи при цьому вихідний диплоїдний набір хромосом.

Табл.10.4.Найбільш розповсюджені лінії клітин

Висновок

Багаторазові  поштовхи та численні чинники. Кнудсен  запропонував теорію, згідно якій для  розвитку пухлини необхідні два  поштовхи. Перший пов'язаний з першою зустріччю з канцерогенним агентом  — цей момент називається ініціюванням, а канцерогенна речовина, яка викликає цю зміну — ініціатор. Другий вплив, який стимулює неопластичний ріст, називається промоцією, а агент — промотором. Зараз доведений факт існування цих етапів - багаторазових поштовхів (п'ять і більше). Доведено, що дуже багато чинників можуть викликати ці поштовхи, і що кожний поштовх виробляє зміни в геномі клітини, яка піддається впливу, і ці зміни передаються потомству, тобто неопластичному клону. Період між першим поштовхом і виникненням клінічно визначеної пухлини названий прихованим періодом. У мешканців, які залишилися живими після атомного бомбардування Хіросіми і Нагасакі, найбільше число випадків лейкемії зареєстроване приблизно через 10 років після події, а деяких ракових пухлин — ще на 20 років пізніше. Довгий прихований період пояснює труднощі ідентифікації канцерогенних агентів для новоутворень, які зустрічаються найчастіше. Протягом прихованого періоду в пошкодженій клітині неможливо знайти структурні або функціональні порушення. При точніших методах дослідження можна визначити ці зміни, особливо в геномі, але вони не виявляються морфологічно.