Өсімдік жасушаларын биосинтездік өнеркәсіпте пайдалану

Жоспар:

Кіріспе

1 Жасушаларды культивациялаудың  түсінігі

2 Өсімдік жасушаларын  жасанды қоректік ортада өсіру  әдістері

2.1 Каллусты алу және  оны қолдан өсіру.

  2.2 Сұйық ортада жасушаларды  қолдан өсіру.

2.3 Суспензионды жасушаларды  алу.

3 Жасанды қоректік ортада  өсетін жасушалардың биологиясы

3.1 Өсірілген жасушалардың  әртектілігі.

4 Өсімдік жасушаларын  биосинтездік өнеркәсіпте пайдалану

5 Жасушаларды өсіру жүйелері

5.1 Иммобильденген жасушалар.

5.2 Қосымша заттарды алу  үшін жасушалық технологияларды  дайындау жұмысының кезеңдері:

Пайдаланылған әдебиеттер тізімі

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Кіріспе

 

Биотехнология – экономикалық маңызды заттар өндіру үшін,  өсімдіктердің жаңа сорттарын, жануарлардың жаңа түрлерін, микроорганизмдердің штаммаларын алу үшін биологиялық процестер мен объектілерді пайдаланатын ғылым мен өндірістің жаңа саласы.

Биотехнологияның негізгі мақсаты -  мәдени өсімдіктердің жаңа сорттарын шығаруға қажет селекциялық материалды аз уақыт ішінде алу үшін өсімдік жасушаларын өсіру.

Өсімдік клеткаларын қолдан өсіру дегеніміз өсімдіктің жеке жасушаларын,  ұлпаларын,  мүшелерін асептикалық жағдайда жасанды қоректік ортада өсіру.

Өсімдік ұлпасының стерилденген кішкене бөлшегін Петри чашкасының немесе пробиканың ішіне агаризонды қоректік ортаға орналастырады. Содан кейін ұлпада жасушалар белсенді түрде бөліне бастайды. Жасушалық түзілім тез өсіп каллус түзеді. Каллус дегеніміз дифференцияланбаған жасушалардың жинақталып  ерекше ұлпа түзуі. Егер осы каллустың бөліктерін балғын қоректік ортаға отырғызса, онда олар шектеусіз өсе алады.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1 Жасушаларды  культивациялаудың түсінігі

«Өсімдік жасушасын қолдан өсіру» термині ауқымды және ыңғайлы ұғымға айналды,  ол бөлініп алынған жасушаны, ұлпаны, мүшелерді, ұрықты және тұтас өсімдік-регенерантты қолдан өсіретін  in vitro-ның барлық жұмыстарын қамтиды. In vitro термині (лат.- шыныда, әйнекте) стерильді жасанды қоршаған ортада өтетін процестердің жағдайларын сипаттау үшін қолданылады. In vivo (лат. – тіршілікте) организмнің тіршілік процестерінің  табиғи стерильді емес  ортада өтуі. Өсімдік-регенерант дегеніміз асептикалық түрде  алынған,  тамыры мен өркені  мәдени ортада қалыптасқан өсімдік, демек  in vitro.

Теориялық түрде кез келген өсімдік жасушасы  өзін бөліп алған организмге дейін дамуға потенциалды түрде қабілетті және ол белгілі бір жағдайларда қолдан өсірілген. Бұл қасиет тотипатенттілік деп аталады. Тотипатенттілік (лат. totus – барлық, тұтас,  potential – күш) –  тұтас организмге дейін дамуын қамтамасыз ететін өзіне тән генетикалық ақпаратты сақтап, үйлестіретін жасушаның  қасиеті. Әдетте, әмбебап тотипатенттілік қасиетке өсімдіктің және жануардың ұрықтанған жұмыртқа жасушасы ие. Ал сомалық жасушалардан тотипатенттілік қасиетке тек қана өсімдік жасушалары ғана ие, әрі ол  in vitro жағдайында ғана. Қолдан өсірілетін жануарлар жасушасы тотипатенттілік қасиеттен айырылған.

XIX-XX ғасырларда алғаш  рет  неміс ғалымдары өсімдіктің  бөлініп алынған бөліктері мен  мүшелерін өсіре бастады. 1883 жылы  К.Рехингер бүршіктерді, тамыр мен  сабақтың телімдерін ылғалды  құмда өсіруге тырысқан. Ол кейбір  тәжірибелерінен каллустың түзілгенін  байқаған, алайда қорекпен қамтамасыз  етілмегендіктен және стерильді  жағдайлар сақталмағандықтан ұзақ  өсетін өсімдіктерді ала алмаған. Мұндай тәжірибелерді Х.Фехтингте  жүргізген.

1902 жылы Г.Габерланд жасушаларды  қолдан өсіру принциптерін алғаш  рет нақты қалыптастырды. Ол бірқатар  жабық тұқымды өсімдіктердің  жапырағынан бөліп алынған паренхима  жасушаларымен тәжірибе істеді  және қоректік орта ретінде  сахароза, аспарагин, пептол қосылған  Кноп ерітіндісін қолданды. Г.Габерланд  өсімдіктің кез келген тірі  жасушасы тотипатенттілік қасиетке  ие деген гипотезаны алға тартты  және жалғыз бір жасушадан  ұлпа өсіруге тырысты. Бірақ ол  өзінің керемет жаңалығын экспериментті  түрде дәлелдей алмады, өйткені  ол қолайсыз объектілерді тандаған  болатын: белсенді түрде бөліну  мен эмбриональды өсу қабілеттерін  жоғалтқан жіңішке дифференцияланған  арнайы жасушалар. Кейіннен белгілі  болғандай жас ұлпалардың меристемалық  және белсенді қызмет жасайтын  жасушалары ғана  қолдан сәтті  өсіріледі.

Сонымен қатар өсімдік жасушаларын организмнен тыс өсіру жануар объектілерімен айналысушы ғалымдарды да қызықтыра бастады. Алғаш рет жануардың бөлініп алынған жасушасын өсіру мүмкін екендігі дәлелденді. 1904-1907 жж Р.Харрисон бақаның нейробластын лимфа сұйықтығында өсірді. Осыдан кейін жануарлардың жасушасын қолдан өсіру әдістері жасала бастады, қоректік орта ретінде лимфа, қан плазмасы, ұрық сұйықтығы пайдаланылды. Организмде жануарлар жасушасы қанмен және лимфамен қоректенеді,  сондықтан оларды осындай қоректік ортада өсіру табиғиға ұқсас болып келеді. Ал өсімдік организмінің қоректік заттарға бай болып келетін мұндай сұйық ортасы жоқ, тіпті флоэма экссудатыда мұндай талаптарға сай келмейді.

Ботаниктер өсімдіктердің бөлініп алынған мүшелері мен бөліктерін өсіру үшін қолданған қоректік орталарының құрамы алғашында қарапайым болды, қоректік орталарының құрамы негізінен минералды тұздардың қосылыстарынан ғана тұратын. 1922 жылы бір мезгілде Германияда В.Котте мен АҚШ-та В.Роббинссон өсімдік ұлпаларын қолдан өсіру жетістігіне жетті. Олар меристемалық жасушалары бар ұлпаларды  қолданды - бүршіктер мен тамыр ұштары. В.Котте жүгері мен бұршақтың тамыр ұштарын қолдан сәтті өсірді. Ол құрамында Кноп ерітіндісі, глюкоза, кейбір аминқышқылдары және пептон бар әртүрлі қоректік орталарды  қолданды. В.Роббинсон жүгерінің тамырын өсіріп, қоректік ортаға ашытқы сығындысын қосты. Алайда тамыр мынадай қоректік ортада ұзақ тіршілік етпеді. 10 жылдан кейін АҚШ-та Филипп Уайт В.Роббинсонның тәжірибесін қайталады, бірақ ол қызанақтың тамыр ұштарын қолданып, жақсы нәтижелер алды.

Ф.Уайттың қызанақтың тамыр ұштарына жасаған тәжірибесі мен француз ғалымы Роже Готренің шілік пен сәбіздің камбий ұлпаларына жасаған тәжібесі 30-шы  жылдары ұлпаларды қолдан өсірудің қазіргі заманғы әдістердің негізіне айналды. Ф.Уайт тамыр ұштарын қолдан өсіру тәжірибесін 30 жыл бойы үздіксіз жүргізді, ал Р.Готре сәбіз тамырының камбиі мен флоэмасынан каллусты клондар өсірді. Ол қоректік ортаға ауксин қосып және ауксиннің  камбий жасушаларының бөлінуіне әсер ететін қабілеті бар екендігін көрсетті  Ф.Уайт пен Р.Готре өсімдік ұлпаларын қолдан өсірудің заманауи әдістеріне өте бағалы жаңалық енгізді және осы уақыттан бастап өсімдіктердің эксперименттік биологиясының жаңа бағыты белсенді түрде дами бастайды.  Көптеген қоректік орталардың құрамы жасалынды және макроэлементтердің, микроэлементтердің, витаминдердің, өсімдіктердің өсуін реттеушілердің (кокос жаңғағының, каштантың, жүгерінің эндорспермдері, ашытқының гидролизты және т.б.) маңызы зерттелді. Осы соңғы күрделі органикалық қосылыстар бөлініп алынған ұлпаларға қосылмаса жасушалардың бөлінуі мүмкін болмайды. Бұл осы қосылыстарда жасушалардың бөлінуін реттейтін фактор бар деген ойға әкелді.

Америкалық ғалым Ф.Скуг қызметкерлерімен бірге темекі сабағының телімінде бүршіктердің өсуін зерттеді және құрамында минералды тұздары, көмірсулары және витаминдері бар қоректік ортаға өсірді. Каллустың түзілуі, кейде бүршіктердің қалыптасуы байқалған. Қоректік ортаға ауксиннің қосылуы бүршіктердің өсуі мен қалыптасуын тежеді. Ал ортаға аденин  керісінше бүршіктердің қалыптасуына әсер етті және ол ауксиннің тежеушілік әсеріне бөгет жасады. Бұл зерттеушілерді кокос сүтінің өсу факторында қандай да бір пуриндік заттар бар деген ойға әкелді. Сондықтан олар алдымен нуклеин қышқылдарын зерттеуді бастайды.  Содан кейін сельд спермасының ДНҚ-сы темекі жасушаларының бөлінуіне әкелетіні анықталады. Осы нәтижені ұзақ уақыт бойы сақталған ДҚН-ның ескі препараты тапты – соған қарағанда өсу факторы ДНҚ бұзылуының өнімі болғанға ұқсайды. Ф.Скуг пен оның қызметтестері темекі сабағының паренхима клеткаларының бөлінуіне және ауксиннің қатысуымен бүршіктердің дамуына әсер ететін затты ашытқыдан бөліп алды.  Бұл өсуді реттейтін затты олар кинетин деп атап,  ал кинетин жататын өсуді қамтамасыз етуші класты цитокининдер  (жасушаның бөлінуін қамтамасыз ететін заттар) деп атады. Осы жаңалықтың арқасында Т.Мурасиге мен Ф.Скуг 1962 жылы темекі каллусының өсуіне қажет атақты қоректік ортаның құрамын жасады. Бұл қоректік орта көптеген өсімдік түрлерінің әртүрлі ұлпалары мен мүшелерін қолдан өсіруге бірден бір лайық орта болып саналды және қазіргі уақытта осы орта кеңінен қолданылады.      

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2 Өсімдік жасушаларын  жасанды қоректік ортада өсіру  әдістері

 

Өсімдіктердің жасушаларын, ұлпаларын және мүшелерін қолдан өсіру сәтті  шығу үшін жасанды ортаның құрамының жақсы болуымен қатар  әртүрлі қолайлы жағдайлар жасалуы қажет. Осы айтылған сөзге жасушаны қолдан өсіру сәтті болуы үшін үнемі температура шамамен  25±2°С болуы қажет деп жалпылай қабылданған шешім дәлел болады. Алайда мұндай дәстүрлі тәсіл ақпараттың аздығынан қолданылған болатын. Өйткені темекінің каллусының өсуіне 32°С, кәдімгі гармалаға 30°С, ипомеяға 30-32°С қажет.

Температура өсімдікте жүретін метаболизм процестерінің бәріне  әсер етеді. Температураны эксперименттің мақсатына байланысты әрбір объектіге жекелей лайықтыланып қойылуы керек. Бірақ мұндай тәжірибелерді жүргізу үлкен еңбек пен ұзақ уақытты талап етеді, сондықтан ғалымдар жасушаларды шамамен 25°С температурада өсіре береді.

Жасушаларды қолдан өсіруге әсер етуші сыртқы факторлардың бірі – жарық. Қазіргі уақытқа дейін фотоавтотрофтылық тек 16 өсімдіктің түріне ғана тән екені сипатталып жазылған. Қалғандары фотоавтотрофтылық өсуге қабілетсіз, оларды қараңғыда немесе әлсіз түскен жарықта өсіреді. Хлорофилдерінен айырылған ұлпаларға жарықтың әсер етуі фитохромды жүйемен қамтамасыз етілген. Екіншілік қосылыстарды алу үшін қолдан өсірілетін жасушаны қолданатын эксперименттерде жарық пен фотопериодтың белсенділігі мен сапасының  әсері нақты тағайындалған. Жасуша технологиясында жасушаларды жарықпен қамтамасыз ету  басты міндеттердің бірі.   

Жасушаларды сәтті өсіру үшін қажет маңызды факторлардың  бірі – аэрация. Аэрациясыз ешбір жасуша тіршілік ете алмайды. Газдардың (оттегі, азот, көмірқышқыл газы) жасушаларға әсері мүлдем зерттелмеген.

Жасушаларды өсіруде және жасанды ортасын жасағанда физикалық фактор осмос қысымыныңда әсерін ескеру қажет. 

 

2.1 Каллусты алу және оны қолдан өсіру.

Каллус – жасушаның қалыптаспаған пролиферациясынан пайда болған ұлпа. Пролиферация – жасушаның және ұлпаның бөлінуінен пайда болған жаңа түзілімдер. Каллус (лат. callus – тірі тері, мозоль) – өсімдікте жарақаттанудың нәтижесінде пайда болған ұлпаның ерекше түрі. Ол жараның орнын қорғайды және қоректік заттар жиналып арнайы қорғаныш қабаты түіледі немесе жараланған мүше қайтадан қалыптасады. Мұндай жасушалар ұлпалар мен жасушаларды қолдан өсіру барысында да пайда болады. in vitro каллусының түзілуі және өсуі ауксин мен цитокининмен реттеледі.

Каллусты алу және оның ары қарай өсуі стерилбдікті талап етеді. Жақсылап жуылған өсімдік материалы құрамында белсенді хлор (кальций мен натрий гипохлориті, хлорамин, хлорлы әк), сынап (сулема, диоцид), сутегі диоксид, этанол бар әртүрлі заттармен стерилденеді. Осындай мақсатта бромды, күкірт қышқылын, фенолды және ерекше жағдайларда антибиотиктерді сирек қолданады. Стерилдеуші заттың түрі, концентрациясы әсерт ету ұзақтығы стерилдеуге дайындаған өсімдік объектісіне байланысты болады. Стерилдеуші зат барлық микроорганизмдерді жоятындай және өсімдік ұлпаларын минимальды жарақаттайтындай әсер етуі тиіс, сонда стерилдеуші зат дұрыс таңдалған болып табылады. Сонымен қатар стерилді зат сумен жуғанда кетуі тиіс, әйтпесе ұлпалардың улану қауіпі туады да эксперименттің нәтижесіне кері әсер етеді. Әдетте танымал стерилдеуші әдістерді қолданады немесе әрбір объектіге экспериментті түрде арнайы стерилдеу әдісін жасайды. Қолайлы стерилді қоректік ортаға орналастырылған эксплант деп аталатын ұлпаның немесе мүшенің фрагменті біраз уақыт өткеннен кейін өсе бастайды да каллус пайда болады. Бұл процесс  каллустың түзілуі немесе каллусогенез деп аталады.

  

  2.2 Сұйық ортада жасушаларды қолдан өсіру.

Сұйық ортада қолдан өсірілген өсімдік жасушысын суспензионды культура деп атайды. Жасушаларды белгілі бір өлшемде сақтау үшін оларды әртүрлі аппараттармен араластырып тұрады. Жасушалардың аэрациямен қамтамасыз етілуі ортаны араластырудың немесе шайқалуының немесе сұйық ортаның таза ауамен желдетуінің әсерінен болуы мүмкін. Жеке эксперименттерде жасушаларды инкубациялау үнемі қоректік ортамен қамтамасыз етіліп тұрмайды, керісінше сұйық ортамен және ауамен біртіндеп қана қарым-қатынас орнатады. Мұндай жағдайда газ алмасу жақсарады.

Суспензиядағы жасушаны агаризонды жазықтықта статистикалық тәсілмен өсірілген жасушамен салыстырғанда ерекшеліктері болады: жасуша популяциясы біртүрлі қоректік ортада, аэрацияда болады; экзогенді факторлардың жасушалардың өсуіне және метаболизміне әсер етуін оңай бақылауға болады; олар биохимиялық және молекулалық-биологиялық зерттеулер жасауға қолайлы болып келеді; олардан қалыпты жасуша популяцияларын алу мүмкіндігі жоғары.

 

 

2.3 Суспензионды жасушаларды алу.

Әдетте суспензионды жасушаны алу  үшін каллусты ұлпалар қолданылады. Сұйық ортаға орналастырылған эксплантты өсімдікті алу мүмкін (мысалы, пыльниктерді). Экплант бетінде пайда болған каллусты жасушалар бөліне алады және ортаға өтіп суспезияның басталуына негіз болады. Бірақ бұл ұзақ әрі нәтижесі төмен процесс. Кейбір зерттеулер үшін қажет жасушаларды ферментті мацерация тәсілімен алады, мысалы: жапырақ мезофилінен, бірақ мұндай суспензияны ұзақ уақыт бойы сақтап қалу мүмкін емес.

Суспензионды жасушаларды алудың негізгі тәсілі тербелгіштегі сұйық ортада борпылдақ дифференциалданбаған каллусты өсіру болып табылады. Мұндай жағдайда каллус жеке жасушаларға және жасушалық агрекаттарға оңай ыдырайды. Борпылдақ каллусты арнайы осындай мақсаттар үшін 2,4-Д және құрамы азайған немесе цитокинині жоқ ортада өсіреді. Каллустың дезагрегациясына қоректік ортада болмауыда жақсы әсер етеді, бірақ мұның салдарынан өсімдік жасушаларын байланыстырушы негізгі материал – кальций пектинаты аз мөлшерде түзіледі. Кальций пектинатын каллусқа пектизамен әсер ету арқылы бөліп алуға болады.

Сұйық ортадағы каллусты ұлпалардың бөліктері араластырудың әсерінен  жасушаларға және жасушалық агрегаттарға ыдырап алғашқы суспензияны түзеді. Каллустың ірі қалдықтары мен ірі жасуша агрегаттарынан құтылу үшін 1-2 қабат марлы немесе нейлон қолданып сүзеді немесе суспензияны тұндыру арқылы алады. Жасушалардың диссоциясына қоректік ортаның құрамы, аэрация және суспензияны араластыруда әсер етеді. Ешқандай әрекеттерге қарамастан суспензия ешқашан жалғыз жасушалардан  тұратын бір түрде ғана болмайды.