Өсімдік жасушаларын биосинтездік өнеркәсіпте пайдалану

Сөйтіп, жасанды қоректік ортада өсірілген жасушаларды генетикалық информация сақталады, бірақ оның жүзеге асуы үшін ерекше жағдайлар қажет. Шамамен, жоғары өнімді өсімдіктер мен ұлпалардың бөлініп алынған жасушаларда сол метаболиттердің биосинтезіне қажет генетикалық информациясы болады.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

5 Жасушаларды  өсіру жүйелері

Жасушаларды in vitro жағдайында өсірген кезде олардың өсуі мен биосинтездеріне өсіретін жүйелердің техникалық көрсеткіштерінің маңызы зор. Өсімдіктердің қосымша заттарының биотехнология өндірісі көбінесе сұйық ортада өсетін жасушаларға негізделген. Лаборатория жағдайында қосымша метаболизмді зерттеген кезде жасушалар әдеттегідей колбаларда кішігірім көлемде (40-200 мл) өсіріледі және айналмалы тербеушілерде араластырылады. Колбалардың айналу жылдамдығы (әдетінше минутына 90-120 айналым) жасушалардың өсуіне және метаболиттердің жинақталуына әсер етеді. Мысалы, итжидек пен үйеңкі жасушаларының айналу жылдамдығы төмендегенде, олардың өсуі бәсеңдеген. Ал темекі жаушаларының өсуіне айналу жылдамдығы әсер етпеген, тіпті жылдам айналдыру арқасында оларда никотин синтезі арта түскен.

Көлемі шағын колбалардан көп литрлік ферментерлерге ауысқанда өсіру көрсеткіштері өзгереді, әсіресе араластыру мен аэрациясы. Жасушалар суспензиясын өндірісте өсіру үшін микроорганизмдерге қолданылатын аппараттарды қолданады. Бірақ соңғы зерттеулер көрсеткендей, өсімдік жасушалары өздерінің өзгешеліктеріне қарай ерекше аппараттарды қажет етеді.

Өсімдік жасушаларының көлемі бактериялар мен саңырауқұлақтарға қарағанда 10 есе, тіпті 100 есе ірі келеді, мұнымен қатар онтогенезде де олардың көлемі өзгереді. Бастапқы экспоненциялдық өсу фазасында олар майда және тығыз болса, стационарлық фазасында көлемі өсіп вакуолі пайда болады. неғұрлым жасушаның көлемі үлкейсе, соғұрлым оның араластыру арқасында бүлінуінің қауіптілігі арта түседі. Сонымен қатар, өсімдік жасушалары ірі және ауыр болған соң оларды жақсы араластырып тұұру қажет. Өйтпесе олар ферментердің түбіне түсіп, тез қартаяды да ақырында жойылады.

Жень-шень жасушаларын турбиналық араластырғыштары болған ферментерде өсіргенде айналу жылдамдығы минутына 100-350 айналымнан асқанда, соның теріс әсері салдарынан жасушаларда антрахинондардың синтезі төмендеген.

Штамның механикалық стресіне төзімділігі жасушаларды өсіргендегі маңызды талап, ал зерттеушілер үшін бұл қиын мақсат. Суспензияны жұмсақ араластырып ауамен қамтамасыз етуге пневматикалық әдісі қолайлы, яғни ферментерге ауаның қысым күшімен жоғары көтерілген ағыспен келген стерильді ауаны үрлету. Бірақ юұл әдістің де кемшілігі бар, себебі суспензияда ауа артық мөлшерде болуы себебінен жасушалар оттегінің кемшілігіне тап болады. ал жасушалардың өсуі де, қосымша метаболизмі де оттегі мөлшерімен тығыз байланысты.

Микроорганизмдерді өсіретін жүйелерде биомассаның өсуі, өнісді шығару және оттегімен қамтамасыз ету арасындағы өзара тәуелдігі зерттелген. Ал өсімдіктер жөнінде мұндай деректер жоқ. Жасушалардың өсуіне басқа газдар да әсер етеді. Мысалы, көмірқышқыл газы өсудегі лаг-фазаның ұзақтығына ықпал етеді. Өте күшті аэрация да теріс әсер етуі мүмкін, себебі көмірқышқыл газы мен ұшқыш қосылыстар айдалып әкетіледі. Өсімдік жасушалардың in vitro  жағдайында микроорганизмдермен салыстырғанда тыныс алудың қарқындылығы едәуір төмен, оларды өсіретін ыдыстарды дайындағанда бұл ескеретін жағдай.

Жасушаларды әр түрлі ферментерлерде өсіріп, олардың өсуі салыстырылған. Мысалы, лимонжапырақты моринда жасушаларын өсіргенде, антрахинон 30 % артық болған. Ал басқа түрлі ферментерлермен салыстырғанда тіпті екі есе артық болған. Жасушалардың биомассасы биореактордың түріне байланысты болмаған.

Өсімдік жасушалары сұйық ортада жақсы өсу үшін тығыздықты талап етеді. Ол мынандай кедергіні туғызады: биомассаның өсуімен қоса суспензияның тұтқырлығы да өседі. Оның нгәтижесінде адгезия пайда болады, жасушалар бір-біріне, ыдыстың қабырғаларына, былғауы пен датчиктерге жабысып, өсіруге бөгет жасайды.

Ыдыстың жоғары жағында жасушалар бөліп шығарған белоктар мен полисахаридтерден тұратын көбік біртіндеп жинала бастайды. Өсе келе кейбір жасушалар өзара жабысып, осы көбікте жиналып «қабықты» немесе «безені» түзеді. Жасушалар биомассасы өсе келе бұл қабық та қалыңдайды, ақырында араластыру қарқындылығы төмендеп, жасушалар құриды.

Жалпы, өсімдік жасушаларының, микроорганизмдермен салыстырғанда, физиологиялық және метаболиттік активтілігі төмен болады. өсімдік жасушаның генерация уақыты (жасушаның кезекте екі бөлінуі арасындағы мерзім) микроб жасушаның генерация уақытынан 60-100 есе арта түседі.

 

5.1 Иммобильденген жасушалар.

Агар қосылған қатты қоректік ортада өсірген жасушалар сұйық ортада өсірген жасушаларға қарағанда қосымша метаболиттерді көбірек синтездейді. Тәжірибелер көрсеткендей, борпылдақ қарқынды өсетін каллусқа қарағанда тығыз баяу өсетін каллус жасушалары алкалоидтарды артық жинақтаған, яғни әдеттегі метаболизм жасушалардың кеңістікте әлдеқандай ұйымдасуын талап етеді. Жасушаның организмде жайғасқан орны оның дифференциялану типі мен дәрежесін белгілейтін факторлардың біреуі. Бір-бірінен аулақтанып немесе кішігірім топта өсетін жасушалардың қоршаған ортасы ерекше болғандықтан метаболизм жолдары басқаша болады. Жасушалардың ұйымдасуы тұтас организмге неғұрлым жақын болса, соғұрлым олардың метаболизм жолдары да ұқсас болуы мүмкін. Өсірген жасушаларда қосымша метаболиттердің жинақталуы мен олардың дифференциялану дәрежесінде өзара байланысы бар екендігін ғылыми әдебиеттегі бірталай деректер дәлелдейді.

Иммобаильденген жасушалар өзара тығыз байланыста өседі. Соынң нәтижесінде олардың массасының ішінде тұтас организмдегідей, белгілі химиялық және физикалық градиенттер деп гормондар, қоректік заттар, оттегі, көмірқышқыл газы мөлшері өзгеруін түсінуге болады.

Жасушаларды мынадай төрт жолмен иммобильдеуге болады: 

1)жасушаларды түрлі оқшау (инерттік) заттармен қаптау (альгинат, агар, полиакрилаимд, коллаген, т.б.);

2)оқшау заттың беткі  қабатына жасушаларды абсорбция  арқылы орналастыру;

3)оқшау заттың беткі  қабатына жасушаларды биологиялық  макромолекулалармен (лектиндермен) «тігу»;

4)жасушаларды коваленттік  байланыстар арқылы оқшау субстратқа  орналастыру (мысалы, карбоксиметилцеллюлоза).  Көбінесе алғашқы екі тәсіл  қолданылады. Биологиялық жағынан  оқшау затқа бекінген жасушалар  өз өміршендігін сақтайды. Бекіген  жасушалар төңірегінде қоректік  орта көп мөлшерде жүріп тұрады, оның құрамын өзгертіп, өсу қарқындылығын  бәсеңдетіп, қосымша заттарды көбірек  алуға болады.

Иммобильденген эжасушаларды концентрациясы төмен алғашқы заттармен көп мөлшерде қамтамасыз ету керек.  Бұл алғашқы заттар биосинтез жолдарында алынып отырған затқа мүмкіншілігінше жақын болуы қажет. Иммобильденген жасушалар ұзақ уақыт  өсірілетін болғандықтан, бұл тәсілге өздері табиғи жолмен немесе белгілі факторлардың әсерімен (төмен температура, еріткіштер) қажетті заттарды сыртқа бөліп шығара алатын жасушаларды қолдану керек. Қажетті затты тек ішінде, мысалы вакуоль мен пластидтерді жинақтайтын жасушалар иммобильдендіруге жарамайды. Сонымен бірге жасушаларды шайып тұрған қоректік ортаның өзімен қажетті затты бөліп алу оңай емес.

Өндірісте қолданылатын иммобильденген жасушаларды өсіру үшін биореактордың бағана тәріздісі қолайлы, өйткені мұнда орын үнемделеді және жасушалар арқылы ағып жатқан қоректік ортаны бақылау онайланады. Кейбір өсімдіктер жасушалары метаболизм барысында жарықты қажет етеді.

Иммобильденген жасушалар түрлді заттардың биотрансформациясына да қоданылуы мүмкін. Иммобильденген жасушалар технологияда ұзақ уақыт пайдаланылатын болғандықтан, биокатализ процесі арзанға түседі. А.Альферман қызметтестерімен мынадай тәжірибе өткізген. Олар оймақгүлдің (Digitalis lanata) альгинат гелімен қапталған жасушаларын (диаметрі 4-5 мм 50 түйіршік) Эрленмейердің 100 мл-лық колбаларында 25 мл қоректік ортада өсірді. Биотрансформация өтетін субстрат ретінде β-метилдигитоксин қолданған, ол тәжірибе барысында β-метилдигоксинге айналған. Субстраты бар қоректік орта үш күн сайын алмастырылып тұрған. Осындай жағдайда жасушалар 170 тәулік бойы субстраттың биотрансформациясын жүргізіп, оны қажетті өнімге айналдырып тұрған. Жүрек ауруын емдеу үшін дигоксин өте тиімді. Бірақ, өсімдікте оған қарағанда дигитоксиннің мөлшері едәуіо артық. Екеуінің химиялық айырмашылығы – дигоксиннің 12-ші көміртек атомында қосымша гидроксил тобы бар. Оймақгүлдің каллус жасушаларын биотрансформация реакцияларын өткізу үшін пайдаланып жүректік гликозидтарды өндіруг болады.

Сөйтіп, иммобильденген жасушалардың суспензияда өскен жасушалармен салыстырғанда мынадай артықшылықтары бар:

• биомассаны қайта-қайта ұзақ уақыт пайдалану (жасушалар биреактор ішінде сақтала береді, ал өнімдер қоректік ортадан бөлініп алынады);
• жасушалардың қозғалысы шектелгендіктен, олар қоректік ортаға бөлініп шықпайды, онымен араласпайды;
• жасушалардың мол биомассасын сыйымдылығы шамалы ыдыстарда өсіру;
• жасушаларды ұзақ өсіру;
• биотрансформация мүмкіншілігі.

5.2 Қосымша заттарды алу үшін жасушалық технологияларды дайындау жұмысының кезеңдері:

  1.Экономика жағынан  тиімді өсімдікті таңдап алу. Өсіруге алынатын өсімдіктерде  бағалы, экономика жағынан маңызды  қосымша заттары айтарлықтай  жоғары мөлшерде болуы қажет. Әсіресе бұл жағдайдың сирек  кездесетін немесе жоғалып бара  жатқан өсімдіктерге қатысы бар.

2.in vitro жағдайына ұлпаны  алғашқы енгізу. Ол үшін қажетті  зат жоғары мөлшерде синтезделетін  жеке өсімдіктер тандап алынады. Алдымен алғашқы каллустарда  қатты ортада өсіріп алады.

3.Биомассада қосымша заттардың  сандық және сапалық құрамына  химиялық зерттеу жүргізу. Бөлініп  жатқан каллус жасушаларында  көбінесе қосымша затардың мөлшері  бүтін өсімдіктер мүшелеріне  қарағанда аз болады. Бұл тұтас өсімдікте қосымша заттардың синтезі цитодифференцировканың бақылауында болатындығын дәлеледейді. In vitro жағдайында жасушалардың дифференциялануы басылғанда немесе тежелгенде, қосымша заттардың биосинтезі төмендеуі мүмкін. Осы жағдайды ескерген жөн. Жасушаның генетикалық мүмкіншіліктерінің толық іске аспауына басқа себептер де бола алады, мысалы автотрофтық қоректенуден айырылу. Сонымен қатар, әр түрлі факторлардың ықпалымен өнімдердің құрамы да өзгере алады. Кейбір өсімдіктерде қосымша заттардың метаболизмі өсу процесі бәсеңдегенде басталады, сондықтан оларға алдымен қарқынды өсуге, ал кейін заттардың биосинтезіне лайықты жағдай жасалады.

5.3 Өсімдіктерді клондық микрокөбейту

Маманданған ұлпаның кез келген тірі жасушалары лайықты қоректік ортада өсіргенде, өздерінің тотипотенттік қасиетін жүзеге асырып, регенерация арқылы бүтін өсімдікке айнала алады. Жеке жасушаларда сол өсімдік түріне тән барлық белгілері мен қасиетері сақталған бүтін өсімдіктің түзілуі клондық көбейту технологиясының негізін қалайды.

Клон (грек. сlon – отпрыск, ветвь) – жыныссыз жолмен, яғни вегетативтік көбею жолымен түзілетін организм.

Өсімдіктердің клондық  микрокбеюі деген өсімдіктердің  in vitro жағдайында жыныссыз жолмен көбеюі. Соның нәтижесінде пайда болған өсімдіктер бастапқы өсімдікпен және өзара бір-бірімен генетикалық тұрғыдан айнымастай бірдей болады.

Бұл биотехнологиялық әдістің дағдылы вегетативтік жолмен көбеюмен салыстырғанда бірталай артықшылықтары бар, атап айтқанда:

1.Көбею коэффициенті өте  жоғары. Мысалы, гербера, бүлдірген, хризантема, раушанның бір өсімдігінен in vitro жағдайында бір жылдың ішінде 1 миллионнан астам клон өсімдіктер  алуға болады. алма ағашының бір  бүршігінен 8 айдың ішінде 60 мыңнан  астам өркен шығады. Таңқурайдың  бір бұтадағы меристемаларын  бөліп алып өсіріп жылына 50 мыңға  дейін өсімдік алуға болады. сонымен, микрокөбеюдің коэффициенті басқа  вегетативтік көбею әдістерімен  салыстырғанда мыңдаған есе артық.

2.Микрокөбеюмен қатар  өсімдіктер вирустар мен патогендік  микроорганизмдерден сауықтырылады.

3.Сұрыптау процесін жылдамдату. Жаңа сорттарды тез көбейтіп, оларды ауыл шаруашылық өндіріске  пайдалану мерзімі едәуір қысқарады.

4.Вегетативтік жолмен  көбейе алмайтын өсімдіктерді  мысалы, пальманы тек in vitro жағдайында  көбейтуге болады. Осы әдіспен  өнеркәсіп деңгейінде бірқатар  өсімдіктерді көбейтеді.

5.Үнемділік. Арнайы бөлмеде  стеллаждарда орналасқан пробиркаларда  жыл ойы мыңдаған өсімдіктерді  өсіру арқылы теплицалар алаңы  үнемделеді.

6.Жас өсімдіктерді алу, яғни кәрі дарақтарды жасарту.

7.Өсу процесінің жыл  бойы үзбеуге болады, әсіресе  бұл дамуында тыныштық кезеңі  болатын өсімдіктерді көбейтуге  тиімді.

Клондық микрокөбейтудің т.рлі әдістерін ғалымдар ол кезде өтетін морфогенездің өзгешеліктеріне қарай жіктейді. Н.В.Катаева мен Р.Г.Бутенко былай жіктеуді ұсынады: а) бұрыннан болған меристемалардан өскен өсімдіктер; б) жаңадан пайда болған меристемалардан өскен өсімдіктер.

Бірінші типті өсімдіктер бүтін өсімдікте бұрыннан болған меристемаларды (сабақтың апексі, қолтық және бұйыққан бүршіктері) активтендіру жолымен пайда болады. Бұл меристемадан шыққан өсімдіктер генетикалық жағынан аналық өсімдікпен пара-пар, өйткені апекстерді in vitro  жағдайында өсіргенде олар генетикалық тұрақтылығын сақтайды.

Екінші типті өсімдіктер in vitro жағдайында пайда болған бүршіктер мен эмбриоидтардан алынады. Бұл өсімдіктерде маманданған және каллус жасушаларынан шыққандығына байланысты генетикалық өзгергіштіктер орын алуы мүмкін. Сондықтан, шыққан клондар бастапқы өсімдіктен біршама ауытқып кете береді. Сөйтіп бұл әдісті тек каллустары тұрақты немесе регенеранттарда пайда болған өзгерістер табиғи өзгергіштіктен аспайтын өсімдіктерге пайдалануға болады.