Структура организации миокарда и контроля качества в условиях гистологической-диагностической лаборатории

 

 

2.2.2. Этиловый спирт

Его применяют в качестве фиксатора для выявления гликогена, железа, амилоида, но он растворяет липиды. Механизм действия основан на осаждении белков, при этом происходит обезвоживание объектов, что значительно ускоряет проводку. Продолжительность фиксации от 2 ч до 1 сут. Увеличение длительности фиксации, особенно в 100 % спирте1, нежелательно, так как материал значительно уплотняется и происходит его пересушивание. Оптимальная температура для фиксации материала в спирте +4 °С, но ее можно проводить и при комнатной температуре. Если после спиртовой фиксации предстоит резать ткань на замораживающем микротоме или криостате, то кусочки промывают в течение 1 — 2 ч до их полного погружения на дно банки, при этом происходит насыщение ткани водой [12].

 

 

 

2.2.3. Правила работы с фиксаторами

Практически все фиксаторы относятся к токсичным веществам (альдегиды, ацетоны, спирты), некоторые ядовиты (сулема, тетраоксид осмия, метанол), поэтому необходимо соблюдать правила техники безопасности при работе с реактивами, которые используют в гистологической практике.

Фиксацию и вырезку материала необходимо производить в вытяжном шкафу. Материал, извлеченный из фиксатора, содержащего формалин, желательно в течение нескольких минут промыть в проточной воде, так как пары формалина оказывают раздражающее действие на слизистые оболочки глаз и органов дыхания.

При быстрой фиксации материала строчных биопсий доставленный в лабораторию материал в случае необходимости вырезают или разрезают на несколько кусочков и фиксируют с помощью одного из способов быстрой фиксации. Если возможно, то следует часть материала сохранить для изготовления постоянных препаратов [17].

Техника такой фиксации такова:

1. Материал  помещают в металлический сосуд с ручкой и заливают теплым 10 % нейтральным формалином, доводят до кипения, затем промывают проточной водой в течение 2 — 5 мин и режут на замораживающем микротоме или криостате.

2. Кусочки  фиксируют в 100 % ацетоне в термостате при 56 °С в течение 15 мин, затем помещают в хлороформ или ксилол для последующей заливки в парафин.

3. Материал  фиксируют в смеси 10 % нейтрального формалина и 96 % спирта (1:1) в течение 15 мин при 56 °С, затем промывают в 96 % спирте и обезвоживают в 100 % спирте [16].

При фиксации формалином, особенно кислым, возможно появление в срезах темно-коричневого пигмента в виде зернышек или глыбок (результат реакции формалина с гемоглобином ткани) [24]. Пигмент удаляют, помещая срезы на 15 — 20 мин в 1—5 % раствор аммиака или 70 % спирт. После промывания водой препарат можно окрашивать. Хорошо удаляется пигмент в растворе 1 % гидроксида калия в 80 % спирте (1:25): после 10-минутной экспозиции препарат промывают в проточной воде в течение 5 мин [17].

В случаях значительного уплотнения ткани в результате слишком продолжительной фиксации кусочки помещают на 1 — 2 ч в 10 % раствор лимонной кислоты, в результате чего материал становится более мягким и пригодным для исследования. Кристаллический осадок, образующийся после фиксации с применением сулемы, удаляют из кусочков или лучше срезов с помощью йодированного 70 % спирт.

 

 

2.3. Обезвоживание и заливка материала

2.3.1. Обезвоживание материала

После фиксации, для которой применялся формалин, кусочки промывают в течение 6, 12 или 24 ч в проточной воде: на водопроводный кран надевают резиновую трубку, конец которой опускают в широкогорлую банку, закрытую марлей. Для промывки удобно использовать эксикаторы разных размеров, снабженные краном: в отверстие крышки эксикатора опускают шланг, по которому подают воду, а через кран эксикатора ее сливают [16].

В том случае, если в состав фиксатора входила пикриновая кислота, материал следует промыть в нескольких сменах 70 % спирта, после фиксации с использованием сулемы — в йодированном 70 % спирте. Материал, фиксированный для некоторых гистохимических реакций, электронно-микроскопического и иммуноцитохимического исследований, отмывают от фиксаторов в различных буферных смесях.

В случае необходимости кусочки тканей перед обезвоживанием можно уменьшить, подровнять. Если материал после фиксации не сразу подлежит проводке, то его можно оставить в 70 — 80 % спирте.

Затем материал необходимо обезводить. Существует несколько традиционных способов обезвоживания. Самым распространенным является обезвоживание в спиртах восходящей концентрации, начиная с 70 %. Обычно применяют батарею спиртов, состоящую из двух порций 96 % и двух — 100 % спирта. Продолжительность процесса обезвоживания в спиртах в среднем 48 ч в зависимости от качества материала (содержания жира в ткани) и размера кусочков, а также от их количества. При использовании автомата для заливки количество спиртов увеличивают, а при проведении кусочков по спиртовой батарее вручную их осторожно промокают фильтровальной бумагой или салфеткой из марли, что позволяет реже менять спирты в батарее [12].

Процесс обезвоживания можно ускорить, периодически встряхивая кусочки в банках со спиртами или поместив их в термостат при 37 °С. Спирты в батарее необходимо своевременно заменять. Контролировать пригодность спирта позволяет проба с водой. В отлитое из банки небольшое количество спирта добавляют 1 каплю воды. Помутнение раствора свидетельствует о необходимости замены спирта в батарее [16].

Абсолютный спирт можно приготовить из 96 %. Для этого применяют сульфат меди, который помещают в ступку и прокаливают на спиртовке или в термостате, периодически растирая и размешивая до консистенции пыли и бледно-голубого цвета. Затем сульфат меди (1 часть) засыпают в банку с 96 % спиртом (4 или 6 частей), плотно закрывают ее крышкой, взбалтывают и оставляют на несколько дней, периодически встряхивая. Сульфат меди адсорбирует воду из спирта и вновь приобретает синюю окраску. Перед использованием абсолютного спирта проводят его контроль спиртометром или в пробирку с небольшим количеством ксилола (4 — 5 мл) добавляют каплю приготовленного спирта (раствор мутнеет, если спирт недостаточно обезвожен). Хорошим адсорбентом воды из спирта является также силикагель после предварительного просушивания его в термостате.

При отсутствии 100 % спирта в батарею включают еще одну порцию

96% спирта. Однако  в этом случае всегда есть  опасность недостаточного обезвоживания и возникновения трудностей при получении срезов.

С целью ускорения обезвоживания применяют ацетон без примесей (ЧДА), предварительно добавив в него силикагель для удаления остатков воды или дистиллированный ацетон. Обезвоживание проводят в 2 — 3 сменах ацетона от нескольких часов до 1 сут. в зависимости от величины объектов [17].

Обезвоживание тканей возможно с помощью 99% изопропилового спирта, который непосредственно смешивается с парафином без промежуточных растворителей (ксилол, хлороформ и др.). Таким же свойством обладает диоксан, однако в связи с высокой токсичностью он не нашел широкого применения в патогистологической технике.

Для обезвоживания глицерином кусочки ткани последовательно помещают в 60 %, 80 % и 100 % глицерин на 3 — 4 ч, а затем в смесь, состоящую из равных частей 100 % глицерина и ксилола.

Выраженное влияние на скорость обезвоживания оказывает микроволновое излучение. Объекты в 70 % спирте помещают на 20 с в микроволновую печь (2,5 Гц/500 В), а затем дообезвоживают в абсолютном спирте в течение 30 — 60 мин.

Секционный и биопсийный материал часто обезвоживают в аппаратах типа АТ-5 и др. с последующим пропитыванием толуолом, хлороформом или их смесью с парафином. При этом применяют две порции 96 % спирта и две — 100 %. Общая продолжительность обезвоживания 48 ч. Преимущество использования аппаратов состоит в том, что в них материал постоянно перемешивается и находится во взвешенном состоянии. Однако аппарат не включается автоматически после внезапного перепада напряжения в электрической сети, что может привести к пересушиванию большого количества материала [15].

 

 

2.3.2. Заливка материала

Для получения тонких (до б мкм) гистологических срезов необходимо фиксированный и промытый материал залить в плотную среду, предварительно пропитав ею кусочки тканей. В зависимости от способа растворения все заливочные среды разделяют на растворимые в органических растворителях и водорастворимые. К первым относятся парафин, пластические полимеры на основе парафина, целлоидин, ко вторым — желатин, полиэтиленгликоли, полиэфиры, некоторые метакрилаты и т.д.

Парафин — смесь высокомолекулярных предельных углеводородов, продукт перегонки нефти; растворяется в анилине, бензоле, бергамотном масле, целлозольве, хлороформе, декалине, диоксане, бутаноле, пропаноле, толуоле, трихлорэтилене, ксилоле. Каждый из этих растворителей можно использовать в качестве промежуточной среды между спиртом и парафином. Температура плавления различных парафинов от 27 до 62 °С. В гистологической технике применяют парафин с температурой плавления 56 °С. Зарубежные фирмы производят специальный парафин для гистологических исследований, содержащий различные пластические полимеры, такие как диметилсульфоксид [16]. Их коммерческие названия «Парапласт», «Парапласт плюс», «Гистопласт С», «Гистозес».

Важнейшим условием успешной заливки материала является своевременная смена реактивов в процессе их загрязнения, а также соблюдение рекомендуемых временных и температурных параметров. Кроме того, нужно стремиться к тому, чтобы одновременно заливать одинаковые по толщине и плотности кусочки ткани.

Заливка в парафин позволяет получать гистологические срезы больших размеров (гистотопографические срезы), например срезы всего органа (матка, почка) или его значительной части (доля легкого). Заливку проводят вручную, и для нее требуется дополнительное время на всех этапах [12]. Для приготовления таких срезов из ткани головного мозга с помощью мозгового ножа делают срез свежей ткани толщиной около 1 см и закладывают в ванну с фиксатором. Для того чтобы сохранить плоскую конфигурацию среза, его кладут между двумя проволочными сетками, которые притягивают друг к другу резиновыми кольцами. Продолжительность фиксации 48 ч. После промывки в проточной воде (3 — 4 ч) следует обезвоживание в 70 %, 96 % и 100 % спирте (по 2 смены) в течение 48 ч. Для обезвоживания можно применить изопропиловый спирт, обеспечивая частую его смену и температуру 45 °С (в термостате). Это позволяет избежать получения чрезмерно жестких препаратов. В качестве промежуточной среды используют метилбензоат или хлороформ — 3 смены по 3 дня. Объекты заливают в парафин или парапласт, имеющие температуру плавления 56 — 58 °С.

 

 

2.3.3. Приготовление парафиновых блоков

Пропитанные парафином кусочки ткани выкладывают в специальные формочки и заливают расплавленным в термостате или на водяной бане при 60 °С парафином, в который добавлено 1 — 3 % воска.

Для получения парафиновых блоков нужной формы используют различные приспособления. К ним относятся изготовляемые самим лаборантом бумажные коробочки, на дно которых выкладывают кусочки, а рядом к боковой стенке ставят этикетку номером кнаружи; металлические Г-образные угольники или разъемные формочки, которые перед употреблением смазывают глицерином и помещают на нагретую металлическую пластинку, выполняющую роль дна формочек. Применяют также различные пластмассовые коробочки и формы, в частности используемые в микробиологии, особенно при заливке мелких объектов, таких как материал пункционных биопсий [17].

Специальные импортные аппараты для заливки в парафин (так называемые заливочные центры) снабжены набором различных формочек (кассет) и пинцетов. В них обеспечивается автоматическая подача дробных доз парафина оптимальной температуры.

Раскладывание кусочков в формочки и их ориентирование нужно проводить быстро теплым пинцетом. Если материала для заливки много и он быстро остывает, то можно использовать парафин, подогретый на водяной бане до 60 °С. Для охлаждения формочки с материалом рекомендуют помещать в воду при 10— 18 °С, но не погружать в нее. При застывании парафина поверхность блока стягивается, и в нем образуется кратерообразное углубление. Это нужно учитывать при заливке кусочков и в дальнейшей работе с блоками. Парафин должен на 3 — 4 мм выступать над поверхностью блока, если предстоит монтировать его на деревянную колодку. Возможны также заливка блока большим количеством парафина и резка без использования деревянных колодок, с успехом применяемая даже на санном микротоме [16].

В большинстве руководств рекомендуют после подравнивания и удаления лишнего парафина наклеивать блоки на деревянные бруски с помощью подогретого на спиртовке металлического шпателя или скальпеля. Затем для обеспечения более прочного приклеивания основания блок оплавляют с четырех боковых сторон тем же горячим шпателем или скальпелем.

Наиболее распространенной в настояшее время техникой обезвоживания и заливки материала является схема Меркулова [18] (Таблица 1).

Таблица 1.

Схема Меркулова (по Меркулову, 1956)

Этап	Кол-во времени (ч)
Фиксация:
Формалин (10 %)	24
Спирт-формол	24
Жидкость Карнуа	2-4
Этиловый спирт 96—100 %	12-24
Промывание в проточной воде	12-24
Обезвоживание:
Этиловый cпирт 96 %  I	24
Этиловый спирт 96 % II	2
Этиловый спирт 100 % I	24
Этиловый спирт 100 % II	2
Заливка в парафин:
Этиловый спирт+хлороформ (1:1)	6—12
либо Этиловый спирт+ксилол (1:1)	1—3
либо хлороформ	6—12
либо ксилол	1—6
Хлороформ+парафин (1 :1 — «каша») 37 °С	2 —3
либо ксилол+парафин (1:1 — «каша») 37 °С	1—2
Парафин I 56 °С	2
Парафин II 56 °С	1