Структура организации миокарда и контроля качества в условиях гистологической-диагностической лаборатории

Для приготовления красящего состава надо смешать 100 мл насыщенного водного раствора пикриновой кислоты и 5 мл 1%-ного раствора кислого фуксина. Краситель ослабевает при длительном хранении, в таком случае добавляют несколько капель свежего кислого фуксина.

Затем производится окраска препарата по следующему алгоритму:

1. Удаление парафина из срезов в ксилоле и проведение среза через спирты нисходящей крепости до 80 % этанола.
2. Окраска железным гематоксилином Вейгерта в течение 3-15 минут.
3. Промывание в проточной воде в течение нескольких минут.
4. Промывание дистиллированной водой.
5. Окраска красителем ван Гизона в течение 5 минут.
6. Быстрая промывка в дистиллированной воде.
7. Быстрая промывка в двух порциях 96 % этанола, одной порции абсолютного этанола, просветлить в двух порциях орто-ксилола. Время пребывания срезов в каждой порции 1-2 мин.
8. Закрепление препарата нейтральным бальзамом [18].

 

2.4.6 Выявление фибрина — метод ОКГ по Зербино

Метод выявления фибрина ОКГ (оранжевый — красный — голубой) по Зербино является оригинальной модификацией метода MSB. В этом методе используются доступные реактивы преимущественно отечественного производства. Превосходство его в сравнении с методами Вейгерта и Шуенинова состоит в возможности более точной оценки степени зрелости фибрина.

Реагенты:

1. 0,25 %-ная соляная кислота на 70 %-ном этаноле (к 100 мл 96 %-ного этанола добавить 39 мл дистиллированной воды и 0,35 мл концентрированной соляной кислоты (солянокислый спирт)) 139,35 мл,

2. оранж G 0,25 г,

3. фосфорно-вольфрамовая кислота 1 г и 0,5 г,

4. кислотный красный 2С 0,5 г,

5. водный голубой 0,25 г,

6. 96 %-ный этанол 50 мл,

7. ледяная  уксусная кислота 1,25 и 0,5 мл,

8. дистиллированная  вода 50 + 48,75 + 49,5 мл.

Приготовление растворов. Раствор оранжа G; в 50 мл 96 %-ного этанола растворить оранж G и 1 г фосфорно-вольфрамовой кислоты.

1% раствор фосфорно-вольфрамовой кислоты: в 50 мл дистиллированной воды растворить 0,5 г фосфорно-вольфрамовой кислоты.

Раствор кислотного красного: в 48,75 мл дистиллированной воды растворить кислотный красный 2С и добавить 1,25 мл ледяной уксусной кислоты.

Раствор водного голубого: в 49,5 мл дистиллированной воды растворить водный голубой и добавить 0,5 мл ледяной уксусной кислоты.

Примерный протокол окраски срезов методом ОКГ по Зербино (1989): 1)  удалить парафин из срезов в ксилоле и довести через спирты нисходящей крепости до дистиллированной воды;

2) окрасить целестиновым  синим 5 мин, промыть в воде и  окрасить в гематоксилине Гарриса 1—2 мин или Майера 5 мин. Альтернативный вариант: окрасить срезы в железном гематоксилине Вейгерта 3—10 мин;

3) промыть  в водопроводной воде (1 мин);

4) дифференцировать окраску ядер  в солянокислом спирте;

5) промыть в водопроводной воде (1 мин);

6) окрасить в растворе оранжа  G 2 мин;

7) промыть в дистиллированной  воде (1 мин);

8) окрасить в растворе кислотного  красного 10 мин;

9) промыть в дистиллированной  воде (1 мин);

10) поместить в 1 %-ную фосфорно-вольфрамовую  кислоту на 5 мин;

11) промыть  в дистиллированной воде (1 мин);

12) окрасить в растворе водного  голубого 10 мин;

13) промыть в дистиллированной  воде;

14) обезводить в спиртах восходящей  крепости, просветлить в двух  порциях орто-ксилола. Время пребывания  срезов в каждой порции 1—2 мин;

15) заключить  в полистирол или канадский  бальзам.

В результате окраски «молодой» фибрин окрашивается в желтый цвет, «зрелый» — в красный, «старый» — в фиолетово-красный с переходом в серо-голубой, эритроциты — в оранжевый, соединительная ткань — в синий, мышечная ткань — в фиолетовый цвета[11, 12].

 

 

2.4.7 Обзорная окраска препаратов  гематоксилином и эозином

При обзорной окраске гематоксилином и эозином можно использовать любые квасцовые гематоксилины. Более удобны в применении простой гемалаун Майера и гематоксилин Карацци, поскольку после обработки в этих красителях необязательно проводить «отсинение» срезов в водопроводной (или щелочной) воде. Для подкраски препаратов после квасцового гематоксилина можно использовать клк спиртовые, так и водные растворы эозина (0,1—1 %). Спиртовые растворы окрашивают ткани более интенсивно, нем водные. Сохранность спиртовых растворов эозина очень хорошая (около года). Водные растворы менее устойчивы (2—4 нед.).

Примерный протокол окраски гематоксилином и эозином:

1. удалить парафин из срезов в ксилоле и довести через спирты нисходящей крепости до дистиллированной воды;
2. окрасить срезы в гематоксилине Гарриса или Эрлиха 1— 2 мин,
3. промыть в дистиллированной воде 1—2 мин;
4. поместить в подсиняющий раствор (1 капля 10 % раствора аммиака на 100 мл дистиллированной воды) на 1—2 мин (время пребывания в растворе зависит от толщины срезов) или водопроводную воду на 10—15 мин;
5. промыть в дистиллированной воде 5 мин;
6. поместить в водный или водно-спиртовой раствор эозина на 0,5—5 мин (в зависимости от желаемой интенсивности подкраски);
7. быстро промыть в дистиллированной воде (в случае перекраски окраску эозином Y можно дифференцировать в водопроводной воде. Для этого предметные стекла со срезами помещают в водопроводную воду на 1—5 мин, промывают в 80 %-ном этаноле до удаления лишнего эозина из срезов и продолжают обработку в соответствии с пп. 8-9 протокола);
8. дегидратировать и просветлить срезы;
9. заключить в канадский бальзам или полистирол.

В результате окраски ядра клеток приобретают синий или сине-фиолетовый оттенок, а цитоплазма клеток, эритроциты и коллагено-вые волокна соединительной ткани окрашиваются в различные от тенки красного, оранжевого или розового цветов (оттенок может зависеть от способа и продолжительности фиксации материала) [18].

 

 

2.4.8 Окраска хроматофильной субстанции нервных клеток

по Нисслю

Хроматофильная субстанция (субстанция Ниссля или тигроид-ное вещество) в цитоплазме нервных клеток выявляется при помощи различных основных анилиновых красителей. Наилучшие результаты на парафиновых срезах даюттолуидиновый синий, тионин и крезиловый фиолетовый. Существует флуоресцентный аналог окраски нейронов по Нисслю с использованием красителя Neuro-Trace (Molecular Probes).

Лучшие результаты окраски по способу Ниссля получаются при фиксации кусочков головного и спинного мозга в абсолютном или 96 %-ном этаноле, но вполне допустима и первоначальная кратковременная фиксация в формалине (до суток) с последующей фиксацией и обезжириванием в этаноле (не менее 3—5 сут со сменой этанола при необходимости).

Реагенты:

крезиловый фиолетовый 1 г,

дистиллированная вода 100 мл.

Растворяют краситель в теплой (30—40 °С) дистиллированной воде и фильтруют через бумажный фильтр для фильтрации тонких осадков.

Примерный протокол окраски нервных клеток по Нисслю:

1. удалить парафин из срезов в ксилоле и довести через спирты нисходящей крепости до дистиллированной воды;
2. окрасить срезы в растворе красителя 15—30 мин (можно окрашивать срезы на предметных стеклах, накапывая на них профильтрованный окрашивающий раствор);
3. промыть в дистиллированной воде и удалить воду с предметного стекла вокруг срезов фильтровальной бумагой (не промокая срез);
4. обезводить в двух порциях этанола (желательно использовать абсолютный этанол, но допустим и 96 %-ный) по 1— 2 мин, покачивая предметное стекло (для перемешивания спирта и воды, отходящей от среза);
5. поместить в орто-ксилол (на необходимое для последовательной дифференцировки препаратов время);
6. дифференцировать под контролем микроскопа в 96 %-ном этаноле, на 100 мл которого добавлено несколько капель кайепуто-вого (или эвкалиптового) масла или 2—3 капли ледяной уксусной кислоты, до полного исчезновения фоновой окраски нейропиля;
7. промыть в 96 %-ном этаноле;
8. обезводить в абсолютном этаноле или в смеси равных объемов 96 %-ного этанола и орто-ксилола 1—2 мин;
9. просветлить в ксилоле;
10. заключить в полистирол.

В результате субстанция Ниссля — темно-фиолетовая, хроматин и ядрышко — сине-фиолетовые, нейропиль — бесцветный [12].

 

 

2.5. Исследование структуры организации  миокарда в норме и при патологии

Проанализировано 15 гистологических препаратов нормального миокарда, предоставленных гистологической - диагностической лабораторией ГБУЗ НО «Городская клиническая больница № 39 Канавинского района г. Н.Новгорода».

Рассмотрим микропрепарат нормального миокарда (Приложение 7).

На рисунке видно, что клетки имеют удлиненную форму, близкую к цилиндрической. Их концы соединяются друг с другом, так что цепочки клеток  составляют так называемые функциональные волокна (толщиной до 20 мкм).

В области контактов клеток образуются так называемые вставочные диски. Кардиомиоциты ветвятся и образуют пространственную сеть [23].

Их поверхности покрыты базальной мембраной, в которую снаружи вплетаются ретикулярные и коллагеновые волокна. Ядро кардиомиоцита  овальное и лежит в центральной части клетки.

Между мышечными элементами располагаются прослойки рыхлой соединительной ткани с гемокапиллярами.

Так же гистологической - диагностической лабораторией ГБУЗ НО «Городская клиническая больница № 39 Канавинского района г. Н.Новгорода» был предоставлены для анализа микропрепараты миокарда при различных видах патологии.

При описании миокарда обязательна оценка состояния мышечных волокон (изменений ширины поперечников, ядер, саркоплазмы), при наличии фрагментации кардиомиоцитов - её распространённости [20, 21].

Острые повреждения кардиомиоцитов классифицируются следующим образом: релаксация, контрактурные повреждения, миоцитолизис, зернистый и глыбчатый распад. Их выявление требует использования высококачественных микроскопов со светлым и тёмным полем, фазовым контрастом, интерференцией и поляризационным контрастом. Специфические виды дистрофий обнаруживаются также с помощью специальных окрасок. Чаще всего используется ГОФП-метод [22].

Рассмотрим микропрепарат больного М. (65 лет) с очагово-диффузным полиморфноклеточным миокардитом (Приложение 8).

На всей площади среза обилие сливающихся друг с другом густо расположенных мелких очагов умеренной-выраженной фуксинофилии цитоплазмы кардиомиоцитов в виде небольших их участков, окрашенных в красный цвет на жёлто-зелёном фоне.

Выраженная картина очагово-диффузного полиморфноклеточного миокардита с преобладанием продуктивного компонента воспаления. Слабый и слабо-умеренный сетчатый склероз. Неравномерно выраженный отёк межмышечной стромы.

Так же представляет интерес микропрепарат гнойного миокардита (Приложение 9).

На фотографии с микропрепарата ярко видна очаговая инфильтрация стромы миокарда сегментоядерными нейтрофильными лейкоцитами. В просветах ряда сосудов бактериальные эмболы. Множественные густо расположенные, сливающиеся друг с другом мелкие очаги выраженной фуксинофилии цитоплазмы в виде небольших их участков, окрашенных в красный цвет на жёлто-зелёном фоне, формирующих распространённую фуксинофилию миокарда.

Теперь рассмотрим препарат интрамурального кардиосклероза (Приложение 10).

На фоне интактного миокарда (кардиомиоциты окрашены в жёлто-зелёный цвет) мелкоочаговый интрамуральный кардиосклероз с крупной группой кучно, густо расположенных мелких новообразованных сосудов, заполненных ярко-красной кровью.

На микропрепарате представленном в приложении 11 показан очагово-диффузный липоматоз миокарда.

На рисунке видно, что  мышечные волокна миокарда истончены за счёт атрофии, в состоянии волнообразной деформации. Неравномерная окраска кардиомиоцитов. Диффузное выраженное венозное и капиллярное полнокровие миокарда с эритростазами, «монетными столбиками» эритроцитов в капиллярах. Слабо выраженный отёк межмышечной стромы. В срезах представлены небольшие коронарные артерии с практически неизмененными стенками, отдельные из них в состоянии дистонии, нерезкого спазма, окружены начальным периваскулярным кардиосклерозом. Белковая зернистая дистрофия кардиомиоцитов. Признаки дистрофии миокарда в виде сочетания в срезах групп кардиомиоцитов в состоянии слабой и слабо-умеренной гипертрофии, небольших пучков мышечных волокон, истончённых за счёт слабой атрофии, умеренно выраженного очагового периваскулярного липоматоза, мелких очажков круглоклеточной инфильтрации стромы, значительного развития субэпикардиальной жировой ткани. Мелко – и среднеочаговая выраженная фрагментация, небольшие участки волнообразной деформации мышечных волокон миокарда [23].

Так же нами исследовались препараты  миокарда с некрозом (Приложение 12).

В пределах срезов тотальный некроз кардиомиоцитов (кардиомиоциты набухшие, бесструктурные), с выраженной лейкоцитарной инфильтрацией, часть сегментоядерных нейтрофильных лейкоцитов в состоянии распада.

Неравномерная окраска кардиомиоцитов [24]. Очаговое венозно-капиллярное полнокровие миокарда, эритростазы, «монетные столбики» эритроцитов в капиллярах, внутрисосудистый лейкоцитоз различной степени выраженности, диапедезные микрогеморрагии. Неравномерно выраженный отёк межмышечной стромы, варьирующий от умеренного до резко выраженного. Представлен крупный участок некроза кардиомиоцитов (последние набухшие, с потерей ядер и поперечной исчерченности, бесструктурные) с выраженной очагово-диффузной лейкоцитарной инфильтрацией, часть сегментоядерных нейтрофильных лейкоцитов в состоянии распада.