Структура организации миокарда и контроля качества в условиях гистологической-диагностической лаборатории

 

 

 

 

2.4. Приготовление гистологических срезов

 

 

2.4.1. Характеристика и способы  заточки микротомных ножей

Для получения гистологических срезов применяют специальные микротомные ножи, различающиеся по форме, длине и углу сечения лезвия. По форме они представляют собой сложный стальной клин, у которого режущий край имеет дополнительную клиновидную заточку. Длина ножа может составлять от 8 до 50 см.

По конфигурации лезвия различают три группы микротомных ножей: А, В и С. У микротомных ножей, относящихся к группе А, одна поверхность ровная, а другая вогнутая (их называют плоско-вогнутыми с большой кривизной вогнутой поверхности). Эти ножи чаще всего изготовлены из мягкой или относительно мягкой стали и предназначены для резки объектов, залитых в целлоидин [12].

Ножи, относящиеся к группе В, называются плоско-вогнутыми, но кривизна вогнутой поверхности у них значительно меньше, чем у ножей группы А. Они изготовлены из более твердой стали, используют их для приготовления целлоидиновых и целлоидин-парафиновых срезов.

У ножей, относящихся к группе С, обе поверхности клинка плоские. Их изготавливают из твердой стали и применяют для резки объектов, залитых в парафин, а также для получения срезов на замораживающем микротоме. Кроме того, для приготовления парафиновых и полу тонких срезов на микротомах и ультратомах используют металлические магнитные лезвия и стеклянные ножи. Металлическое магнитное лезвие (одноразовый нож) позволяет получить срезы с 50 — 60 парафиновых блоков, затем лезвие меняют.

Получить качественные гистологические срезы при целлоидиновой, целлоидин-парафиновой и парафиновой заливке материала можно с помощью микротомного ножа, толщина лезвия которого должна быть от 3 до 5 мкм. Для работы на замораживающем микротоме необходимо иметь острый нож без зазубрин на лезвии. Нож необходимо своевременно точить, а перед каждой резкой объектов править. Микротомные ножи затачивают с помощью специальных аппаратов, например «Sakura» (Япония). Однако до сих пор не потеряла актуальности и применяется во многих лабораториях ручная заточка ножей. Вручную микротомные ножи точат на камне, имеющем форму бруска. Желтый, так называемый бельгийский камень используют для заточки первым, затем продолжают заточку на белом камне (арканзасе), который имеет более мелкую зернистость. Можно использовать природный аспидный камень, который также имеет крупнозернистую и мелкозернистую поверхность [16].

Перед заточкой на поверхность камня наносят машинное масло или керосин, глицерин, разведенный 70 % спиртом (1:1), мыльную воду. На спинку ножа надевают специальный обушок (желательно постоянно используемый для заточки одних и тех же ножей — это определяет угол заточки), а в стержень или отверстие в торцевой части ножа вкручивают ручку. Затем нож кладут обушком на камень, по которому скользит и лезвие под действием собственной тяжести. Нож проводят по камню с одного конца на другой, а затем, поворачивая через обушок, осуществляют движение в обратном направлении.

Продолжительность процесса зависит от квалификации лаборанта и состояния режущей кромки ножа. В среднем она составляет от 30 мин до 1 ч. Периодически контролируют качество заточки, осторожно укладывая нож на предметный столик микроскопа и перемещая его так, чтобы режущая кромка проходила через поле зрения при малом увеличении. Затем нож правят на широком ремне, натянутом на деревянную колодку. Правку проводят так же, как и заточку (через обушок).

 

2.4.2. Микротомы и особенности работы на них

Микротомы — это приборы, с помощью которых получают срезы тканей, залитых в различные среды, а также замороженных и нефиксированных. Микротомы позволяют получать гистологические срезы различной толщины. По принципу действия различают санные, ротационные, замораживающие микротомы, а также криостаты и вибратомы (Приложение 5).

Санные микротомы характеризуются горизонтальным движением ножа и вертикальным подъемом блокодержателя. Их с успехом используют для резки объектов, залитых в целлоидин, целлоидин-парафин и парафин. Основные части микротома располагаются на специальных салазках, отсюда происходит его название. Принцип работы санного микротома заключается в том, что при обратном ходе ножа ножевые салазки толкают стержень со шкалой регулятора подачи, вызывая его перемещение. Движение стержня передается на тягу, которая с помощью «собачки» поворачивает храповик. Вращение храповика передается микровинту, который с помощью разъемной гайки перемещает салазки с блоком вверх. С каждым срезом блок поднимается все выше на расстояние, соответствующее толщине среза. После того как блокодержатель достигнет высшей точки, с помощью разъемной гайки надо опустить салазки с механизмом в крайнее нижнее положение. Существуют другие разновидности санных микротомов с различными вариантами способов подачи, зажимов для ножей и т.д [19].

Ротационные микротомы предназначены для резки парафиновых блоков, с их помощью можно получать серийные срезы. Важнейшая часть ротационного микротома—механизм микроподачи, который включает в себя храповик, дифференциальный механизм, микровинт, лимб, косозубую передачу и кулачок. Приводной механизм при повороте вала с помощью «собачки» поворачивает на заданное количество зубьев храповик, на оси которого находится зубчатое колесо, передающее через шестерню вращение микровинту. Винт перемещает каретку подачи объекте держателя. Толщина срезов устанавливается поворотом лимба.

Объектодержатель ротационного микротома — винтовой зажим, вмонтированный в шаровую оправу каретки подачи.

Шарнирный механизм позволяет подать блок под любым углом. Объектодержатель фиксируется в зажиме специальной рукояткой.

Держатель для ножа — массивная подставка с двумя вертикальными стойками, в которые вмонтированы двигающиеся держатели, приспособленные для установки ножа под нужным углом. Фиксация ножа осуществляется винтами. В переднезаднем направлении нож перемещается по специальным направляющим с помощью винта. Постепенно приближая нож к объекту и одновременно поворачивая колесо подачи, подравнивают площадь резания, а затем нож фиксируют.

Ротационные микротомы снабжены специальной транспортной лентой, на которую с ножа попадает полоска (серия) срезов. На ленте их разделяют препаровальными иглами и производят дальнейшие манипуляции. Снимать срезы с ножа ротационного микротома можно кисточкой или препаровальной иглой.

Все скользящие поверхности микротомов должны быть чистыми и смазаны тонким слоем машинного или вазелинового масла. При постоянной работе на микротоме все скользящие поверхности необходимо один раз в неделю протирать тряпочкой, смоченной бензином или толуолом, и смазывать. После окончания работы на микротоме объектодержатель и станину очищают от остатков парафина, предварительно вынув микротомный нож и убрав его в футляр. Микротомные ножи никогда не оставляют в микротоме или на рабочем столе! Замораживающие микротомы и криостаты через 30 мин после выключения вытирают насухо и винтовую подачу смазывают вазелиновым маслом.

 

2.4.3. Резание парафиновых блоков на санном микротоме

Парафиновый блок, наклеенный на деревянную колодку или без нее (с большим слоем парафина), зажимают в объектодержатель. Установив нужный угол наклона ножа (оптимальный 13—15°) в зависимости от плотности ткани, медленно подводят нож к блоку, регулируют его высоту до соприкосновения с ножом. Сначала выравнивают поверхность блока, установив микрометрическую шкалу на получение толстых (20 — 25 мкм) срезов, затем шкалу переводят на 6 —8 мкм и приступают к резанию материала. Как правило, нож располагается перпендикулярно, но возможно также получение срезов (особенно с более плотных объектов) ножом, который установлен под углом к станине микротома.

Срезы с блока осторожно снимают с помощью сухой или смоченной в спирте кисточки, используют также изогнутую препаровальную иглу или скальпель. Срезы обычно переносят в коробку, дно которой выстлано бумагой черного цвета, и укладывают матовой стороной вверх. После получения нужного количества срезов рядом с ними кладут блок или этикетку с номером. Удобнее сразу обработать 20—30 блоков, а затем приступить к монтированию срезов на предметные стекла [12].

Часто срезы наклеивают на предметное стекло непосредственно с ножа. Для этого их переносят в склянку с теплой (35—40 °С) дистиллированной или кипяченой водой, а затем вылавливают на предметные стекла, которые предварительно обезжиривают и натирают белком с глицерином. Срезы приклеивают на предметное стекло блестящей, обращенной к ножу стороной. Небольшие складочки на срезе можно расправить, осторожно дотрагиваясь до них углом согнутой препаровальной иглы.

Можно расправлять срезы непосредственно на стекле с помощью специального приспособления для сушки и расправления парафиновых срезов. Для этого на предметное стекло пипеткой наносят каплю воды и в нее опускают срез. Стекло со срезом помещают на нагреваемый столик прибора, где срез постепенно расправляется. После удаления избытка воды пипеткой или фильтровальной бумагой стекло со срезом подсушивают и одновременно срез плотно фиксируется на предметном стекле. На нагреваемом столике прибора помещается одновременно 45 предметных стекол, при его использовании не требуется дальнейшего просушивания стекол со срезами в термостате. Имеются специальные импортные ванночки для расправления срезов и переноса их на стекло. В них постоянно поддерживается оптимальная температура воды 38 °С.

Продолжительность просушивания срезов в термостате при 37 °С 6—12 ч. В случае необходимости проведения срочной окраски срезы можно поместить на 10—15 мин в термостат при 56 °С до начала плавления парафина, что способствует лучшей фиксации среза на предметном стекле. Однако при этом несколько затрудняется депарафинирование: требуется применение дополнительной порции ксилола и увеличение продолжительности депарафинирования.

Существует сухой способ приклеивания срезов к стеклу, который пригоден только для срезов отличного качества. На предметное стекло, смазанное тонким слоем белка с глицерином, помещают срез, аккуратно расправляют его препаровальной иглой или скальпелем и слегка подогревают на спиртовке или нагреваемом столике [17].

При резании материала, залитого в парафин могут возникать ошибки, которые требуют устранения. Например, крошится парафин (причинами может быть то, что он слишком тверд, медленно охлаждался при заливке, низкая температура окружающей среды, большой угол наклона ножа).

Этот недостаток можно устранить с помощью легкого нагрева блока, изменения угла наклона ножа, либо перезалить объект.

Следующая ошибка - ткань отделяется от парафина (причины: заливка проводилась холодным парафином, плохая пропитка материала, при проводке остались следы спирта), устранение: перезалить блок, предварительно поместив его в промежуточную среду (для удаления спирта) [16].

 

 

2.4.4. Подготовка предметных стекол

Предметные стекла, применяемые для получения гистологических препаратов, необходимо предварительно подготовить. Исключение составляют готовые к использованию и специально упакованные импортные предметные стекла.

Предметные стекла моют в теплой мыльной воде или кипятят в 2—3 % растворе гидрокарбоната натрия, затем ополаскивают горячей водой и промывают в течение нескольких часов в проточной воде. Вымытые стекла протирают чистой хлопчатобумажной тканью и на несколько дней помещают в смесь Никифорова: 96 % спирт и эфир (1:1). Обезжиренные стекла извлекают пинцетом из этой смеси, протирают чистой тканью и складывают в коробочку [12].

Для обезжиривания предметных стекол используют также хромовую смесь, в состав которой входят 100 г бихромата калия, концентрированной серной кислоты и 1000 мл горячей воды. Бихромат калия растворяют сначала в горячей воде, затем раствор охлаждают и после этого по стеклянной палочке осторожно по каплям добавляют серную кислоту. Стекла выдерживают в хромовой смеси 2—3 дня, а затем тщательно промывают в проточной воде в течение 1—2 дней.

Предметные стекла также хорошо обезжириваются в крепком растворе соляной кислоты. Через несколько суток их промывают проточной водой и высушивают.

Качество обезжиривания можно проверить, капнув на предметное стекло воду из пипетки: по обезжиренному стеклу вода растекается тонким слоем, а не собирается в каплю.

Для лучшей фиксации срезов на стекле его предварительно смазывают смесью белка с глицерином. Свежий яичный белок взбивают и фильтруют через крупнопористый фильтр, смоченный дистиллированной водой, затем размешивают с равным объемом глицерина и добавляют несколько кристаллов тимола. Смесь хранится в течение нескольких месяцев. Применяют также смесь, в состав которой входят 15 мл сыворотки крови, 5 мл дистиллированной воды и 6 мл 5 % формалина. После фильтрации смесь готова к нанесению на предметные стекла. Ее использование дает лучшие результаты, чем применение яичного белка, так как при окрашивании не образуется фон.

Для нанесения белка на обезжиренные предметные стекла в одну руку берут 5—6 стекол в виде веера, а в другую — чистую стеклянную палочку, которой наносят белок, прикасаясь к каждому стеклу. Затем белок растирают обезжиренным спиртом пальцем по поверхности стекла до его середины, прилагая небольшое усилие. Некоторые авторы рекомендуют натертые белком стекла прогревать в термостате, но опыт показывает, что это излишне так как после переноса срезов на стекла их помещают в термостат или на специальный столик для просушивания, где одновременно происходит коагуляция белка [16].

Разработан способ фиксации среза к предметному стеклу без предварительного натирания последнего белком с глицерином. В ванночку с теплой дистиллированной водой капают несколько капель жидкого казеинового клея и перемешивают. В полученную мутноватую жидкость опускают срезы, расправляют препаровальной иглой и вылавливают на чистое обезжиренное стекло. Этот способ дает неизменно хороший эффект и вокруг среза отсутствует окрашенный фон, как это часто бывает при применении белка.

 

 

2.4.5 Метод окрашивания микропрепаратов  по Ван-Гизону 

Метод окраски микропрепаратов по Ван-Гизону, предназначен для изучения структуры соединительной ткани. Красителем служит смесь кислого фуксина и пикриновой кислоты, причем первый компонент окрашивает коллагеновые волокна в ярко-красный цвет, а второй придает прочим структурам ткани жёлтую окраску. Окраска разработана американским психоневрологом и патологом Айрой Ван Гизоном в 1889 году.