Вірус Сендай

ЗМІСТ

Ст.

ВСТУП          4

ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ        5

1. Історія відкриття вірусу Сендай      5
2. Морфологія вірусу сендай       7
1. Зовнішня будова       7
2. Ліпідна оболонка       9
3. Організація генома та вірусні білки    10
1. Нуклеокапсид       11
2. Вірусна РНК       12
3. Білок F        12
4. Білок NP        13
5. Білки M та NH       13
6. Білоки L та P       14
3. Реплікація вірусу Сендай       15
1. Приєднання вірусу до клітинної поверхні і його проникнення у клітину      15
2. Транскрипція і трансляція      16
3. Реплікація РНК       19
4. Генетичні взаємодії       20
4. Практичне використання вірусу Сендай в медицині та біотехнології         22
1. Історія виникнення методів гібридизації клітини  22
2. Механізм злиття клітин      24
3. Гібридизація соматичних клітин і картування

генів людини        28

4. Одержання α-лейкоцитарного інтерферону   31
5. Використання вірусу Сендай як вірусного вектора 33
5. Методи одержання та інактивації вірусу Сендай   34
1. Одержання
1. Метод 1        34
2. Метод 2        34
3. Титрування вірусу      36
4. Розрахунок титру      37
2. Інактивація        38
1. Інактивація ультрафіолетом     38
2. Інактивація β-пропілактоном     39
3. Інші методи інактивації     40
3. Метод злиття клітин нирок хом’яка з     41

еритроцитами курей

ВИСНОВКИ         42

ЛІТЕАТУРА         43

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

ВСТУП

 

 

Не дивлячись на те, що вірус Сендай відноситься до непатогенних для людини вірусів, і досить давно  використовується як безпечний ініціатор  гібридизації тваринних клітин, його дослідження є виключно важливими  для боротьби зі схожими за будовою  патогенними параміксовірусами.

Встановлення остаточного  молекулярного механізму дії  вірусу Сендай ще не завершено, воно безперечно могло б розширити можливості його практичного застосування. Актуальними  є проблеми встановлення молекулярного  механізму дії вірусу  і пошуку нових шляхів в його застосуванні.

Новизна даної роботи полягає  в її всебічному погляді на проблему даного вірусу, в органічному поєднанні  теоретичного та практичного матеріалу.

Метою даної роботи є дослідження  теоретичної інформації, накопиченої  про будову, механізм проникнення, реплікацію та здатність до гібридизації клітин вірусу Сендай, вивчення всіх можливих варіантів його використання у медицині та біотехнології, у тому числі і найсучасніших, ознайомлення з лабораторними методами роботи з цим вірусом, порівняння вірусу Сендай зі сполуками здатними діяти на клітини схожим чином.

Головною задачею є  формування цілісної картини взаємозв’язку  між теоретичними даними про вірус та їх практичними наслідками у вигляді патогенності і  застосування, дослідження сучасного стану проблеми

 

 

 

 

ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

 

1.ІСТОРІЯ ВІДКРИТТЯ ВІРУСУ СЕНДАЙ

 

 

В березні – травні 1952 р. японські вчені вивчали спалах пневмонії серед новонароджених в палаті педіатричного відділення університету в місті Сендай (Японія). З 17 хворих дітей померло 11. Вік хворих коливався від 1 до 21  дня. Початок  хвороби був раптовим: лихоманка, задишка і ціаноз. Під час рентгеноскопії грудної клітини були виявлені виражені зміни з дифузною тінню в одній  або двох легенях. Автори зробили  припущення про наявність вірусного  збудника у зв’язку з негативним бактеріологічним обстеженням легенів  померлих дітей [1]. В той самий час в сироватках дітей що одужали не було виявлено накопичення антитіл до вірусів грипу типу А та В, вірусів псітакозу-орнітозу, лімфо гранулеми та збудника лихоманки Ку. Під час вірусологічного обстеження з 5 трупів новонароджених, що померли від пневмонії, шляхом інтранзального зараження мишей було виведено вірус (штам Fushimi, відомий як штам Сендай), який потім був адаптований до курячих ембріонів. При дослідження штамів на мишах регулярно спостерігалася важка інфекція з утворенням грипоподібних уражень легеневої тканини. Новий вірус не нейтралізувався сироватками до вірусів грипу типу А, А1, В та С, а також до вірусів паротиту та хвороби Ньюкасла. Позитивні результати серологічних дослідів були отримані з сироваткою дітей що одужали, з сироваткою  матері однієї хворої дитини, яка перенесла невідоме захворювання дихальних шляхів, та з імунною кролячою сироваткою до нового вірусу. В той самий період були виявлені антитіла до цього вірусу в сироватках мешканців міста Сендай при відсутності їх в сироватках трьох інших обстежених районів.

В тому ж році також на мишах було виділено штам Akitsygu з  носоглоткового змиву дорослого  хворого при спорадичному грипоподібному захворюванні. В місті Кіото було виділено штам Nakagawa на мишах від  хворої людини під час спалаху  лихоманки. У 1952 – 1953 рр. штами Tochigi 1, 2, 3 і 4 були виділені на курячих ембріонах. Штам Yamao було виділено від хворого, а через 40 днів після початку хвороби  в його сироватці було відмічено  нарощування антитіл до вірусу Сендай. В 1953-1954 рр. з’явилися повідомлення про виділення цього вірусу в  різних регіонах Японії. До 1954 р. було отримано підтвердження циркуляції нового вірусу на всій території Японії.

Разом з виділенням вірусу Сендай від хворих людей, аналогічні штами були виділені від тварин в  Японії та Китаї.

Ще до офіційного повідомлення про виділення вірусу Сендай Японські вірусологи неодноразово виділяли невідомий  до того гемаглютинуючий вірус від  лабораторних мишей. Результати досліджень в реакціях затримки гемаглютинації, реакції зв’язування компонента і реакції нейтралізації а  також біологічні властивості показали, що новий гемаглютинуючий вірус  мишей не мав спільних компонентів  з відомими на той час вірусами.  Були зроблені висновки, що він ідентичний зі штамом Сендай, які згодом виявилися  хибними.

Вірус Сендай було виділено не лише від мишей , але й від  домашніх свиней, морських свинок і  хом’яків.

В 1957 р. в Пекіні було виділено 2 штами вірусу Сендай при вивчені легенів 23 морських свинок, а серологічними даними було  підтверджена циркуляція вірусу Сендай серед морських свинок і мавп [1].

На сьогодні відомо, що під  виділеним у 50-ті роки вірусом «Сендай», який викликав захворювання легенів  у новонароджених дітей, слід розуміти вірус HPIV типу 1 (англ. Human parainfluenza viruses –  вірус парагрипу людини). Вірусом  Сендай (Sendai virus) називають лише патогенний для тварин (щурів, свиней і т.д.) вірус [2].  Як виявилося HPIV1 і Сендай мають дуже схожу структуру, механізми злиття і антигенності, відносяться до одного типу, проте останній не патогенний для людей.

 

2. МОРФОЛОГІЯ ВІРУСУ СЕНДАЙ

 

2.1. Зовнішня будова

 

Рисунок 2.1 - Схематична будова частинки вірусу Сендай:

А – гемаглютинін;

Б – білкова оболонка;

В – рибонуклеопротеїн  у гвинтовій формі (S-антиген);

Г – гемолізин [3].

Вивчення під електронним  мікроскопом і методом ультрацентрифугування  показало, що частинки вірусу Сендай мають  вигляд  сферичних тілець з діаметром 150-200 нм. Це найбільші з РНК-вірусів. Був також відмічений значний поліморфізм цього вірусу. Під час висушування його частини ставали пласкими, тому їх діаметр дещо перевищував дійсний розмір вірусу; при вивченні препаратів, зафіксованих формаліном, спостерігається кулеподібна форма вірусу Сендай; частини, не фіксовані формаліном, мали більш прозору периферійну зону. Зовнішній вигляд вірусної частинки може змінюватися також в залежності від концентрації солей в середовищі.

За допомогою негативно-контрастного методу було показано, що у вірусу Сендай існує внутрішня складова частина  гвинтоподібної форми [3]. Ця структура є рибонуклеопротеїном.

Елементарні тільця вірусу Сендай розпадаються під час встряхування з ефіром на субодиниці, що мають  властивості 2-х окремих серологічних компонентів: комплемент, що зв’язує (розчинний) S-антиген, який є нуклеопротеїном і гемаглютиніни (V-антиген), що є протеїном [3].

При вивченні субодиниць вірусу Сендай за допомогою ультрацентрифугування  та електронної мікроскопії було показано що антиген має 40-50 нм в діаметрі та 90S (константа седиментації), а S-антиген – 15–20 нм та 37S. Одна вірусна частинка містить приблизно 10 частинок гемаглютиніна. Гемолізин, що міститься в вірусі Сендай, руйнується під дією ефіру. Схематична будова вірусу представлена на рис.2.1.

Нуклеокапсид має спіральну симетрію. Довжина нуклеокапсиду 1 мкм, діаметр 12-18 нм. Крок спіралі нуклеокапсиду 5-7 нм, на кожному витку спіралі  знаходиться 11-13 субодиниць, утворених  нуклеокапсидним білком (NP). Всього в нуклеокапсиді міститься 2400-2800 білкових субодиниць [3]. Нуклеокапсид оточений ліпопротеїдною оболонкою, яка вкрита шипиками, утвореного двома глюкопротеїдами віруса, HN (гемаглютиніни та нейромідаза) і F (білок злиття). Шипики мають меншу довжину, ніж шипики віруса грипу(близько 8 нм). Віріони характеризуються знаною крихкістю, і в препаратах поруч з цілими частинками завжди містяться зруйновані частинки й спіралі нуклеокапсиду(рис.2.2).

Рисунок 2.2 - Віріон вірусу Сендай з частково вивільненим нуклеокапсидом (електронно-мікроскопічне зображення) [4].

В віріонах міститься 5—7 білків з молекулярною масою від 35·10³ до 200·10³, що складають 70% від сухої маси вірусної частинки. Вуглеводи складають близько 6% по масі, й знаходяться в складі глікопротеїдів.

Молекулярна маса вібріона 500·10⁶, коефіцієнт седиментації 1000S, плавуча густина в сахарозі 1,18—1,2 г/см³, в хлориді цезія 1,24 г/см³.

 

 

2.2. Ліпідна оболонка

 

 

Специфічність хімічного складу ліпідної оболонки поряд з надзвичайно  тонкою організацією забезпечує виконання вірусом великої кількості дуже спеціалізованих функцій, починаючи від адсорбції і проникнення в чутливі клітини і закінчуючи специфічним заміщенням клітинних компонентів, плазматичних (зовнішніх) мембран зараженої клітини вірусними під час виходу дочірніх вірусних частини з клітини за допомогою брунькування.

Рисунок 2.3 - Електронна мікрофотографія вірусної частинки вірусу Сендай. По периферичній частині видно спайки зовнішнього шару [3].

Структурним каркасом вірусної оболонки є ліпіди. Ліпіди складають близько 25% сухої маси вірусної частинки. В  віріон включаються попередники  ліпіди клітини хазяїна. В основі такого погляду лежать два фундаментальні спостереження: по-перше склад ліпідів  вірусних частинок в більшій чи меншій мірі відтворює ліпідному складу господаря, і особливо плазматичних мембран, по-друге, в вірусне потомство  включаються молекули ліпідів, утворені перед цим. При цьому не виключається вплив вірусу на ліпідний обмін зараженої  клітини. Зокрема, в роботі Shibаta і  співавторів було описано посилення  синтезу фосфоліпідів у клітинах, заражених вірусом Сендай [5] .

Організація вірусної оболонки в основному аналогічна клітинній  мембрані. Молекули ліпідів утворюють  подвійний центральний шар [6], глікопротеїди складають зовнішній білковий шар. Ці молекули беруть участь в утворенні спайків на поверхні віріона(рис.2.3).

Внутрішній шар утворений  білковими молекулами, що характеризуються високою гідрофобністю (іноді цей  шар називають матриксом віріона).

Таким чином втрата інфекційності  при дії на вірус Сендай ліполітичних агентів пов’язана з тим, що вони призводять до видалення ліпідного  шару вірусної оболонки разом з глюкопротеїдами, відповідальними за адсорбцію і  проникнення вірусу в клітину.

 

 

2.3. Організація  генома та вірусні білки

 

 

Вірус Сендай має несегментований  геном і є негативним РНК-вірусом. Генетична інформація закодована в  негативному РНК-геномі в формі, комплементарній для вірусної інформаційної  РНК (мРНК). Тому геном негативної полярності має транскрибуватися з утворенням позитивної мРНК. Клітини рослин мають  РНК-залежну полімеразу, в той  час як клітини тварин, де розмножується  вірус Сендай, така ферментативна  активність невиявлена [7]. Тобто вірусні гени мають кодувати особливі білкові молекули, здатні транскрибувати негативні геноми РНК-матриці. Вірус кодує 6 видів білка. З них 3 білки ферментного комплексу: білок нуклокапсиду NP, полімеразо-асоційований P, і великий L білок і 3 білки оболонки:   мембранний  білок M , білок злиття F і гемаглютаційний-нейромінідазний HN білок. Крім того в вірусу Сендай було виявлено низькомолекулярний не структурний С білок [4].

 

 

2.3.1. Нуклеокапсид

 

 

Нуклеокапсиди або внутрішні  рибонуклеопротеїди складаються лише з РНК та білків у співвідношенні що дорівнює 1:20 [7]. У вірусних частинках нуклеокапсид існує у вигляді жорстко спаралізованих структур. Морфологічні параметри жорстко поляризованих частинок як правило постійні по всій довжині тяжа. Спіралі нуклеокапсид є ліво закрученими. Середня довжина тяжів складає 1 мкм, що відповідає довжині спірально закрученої РНК.