Вірус Сендай

Зазвичай з гібридів соматичних клітин створювали панелі, в яких були присутні хромосоми людини в мінімальних  кількостях і в найрізноманітніших комбінаціях. Тому для встановлення локалізації гена відповідного ферменту або іншого білка людини не було необхідності застосовувати тільки ті гібриди соматичних клітин, які  містили лише одну хромосому людини [15]. Методи молекулярної генетики дозволили вирішити цю проблему, і зараз за допомогою ПЛР, блоттинга по Саузерну та інших молекулярно-генетичних методів можна тестувати гібридні соматичні клітини на наявність в хромосомах людини,що залишилися, будь-яких генів незалежно від того, чи відомий продукт цих генів чи ні (рис. 4.2).

Рисунок 4.2 - Картування генів людини за допомогою гібридних клітин людина-миша [15].

В гібридній клітині

містяться хромосоми

миші та 2 хромосоми

1 людини

В гібридній клітині

містяться хромосоми

миші, одна хромосома 1 та одна хромосома 

Х людини

В гібридній клітині

містяться хромосоми

миші та одна хромосома 

Х людини

В гібридній клітині 

містяться хромосоми

миші та хромосоми  людини – 1 та Х

Гібридні клітини  через

40 клітинних поділів

Гібридні

клітини

Мітоз

Злиття, утворення  гетерокаріона

Спільне

культивування

Клітина

миші

Клітина

людини

Недоліком методу картування генів  людини за допомогою гібридних соматичних клітин було те, що часто локалізація  генів встановлювалася з точністю до хромосоми. Дозволяють можливості в  картуванні генів таким шляхом були, отже, обмежені. Однак якщо в гібридних  клітинах залишилася тільки одна хромосома  людини, то, опромінюючи такі гібридні клітини рентгенівськими або  гамма-променями, можна домогтися  фрагментації цієї хромосоми і після  отримання нових гібридних клітин за допомогою додаткового злиття з клітинами гризунів (після опромінення  гібридні клітини без додаткового  злиття з клітинами гризунів гинуть) уточнити локалізацію генів, що цікавлять  дослідників, аж до невеликого фрагмента  певної хромосоми (картування за допомогою  радіаційних гібридів). Особливістю  радіаційних гібридів є те, що фрагменти хромосоми людини, утворені після опромінення, не здатні проходити мітоз і губляться, якщо вони не зливаються з хромосомами миші. Ці фрагменти людських хромосом можуть бути настільки невеликими за розміром, що вже не виявляються цитологічно. Тому до проведення дослідів по картування необхідно спеціальними методами, зокрема з використанням ДНК-поліморфних маркерів (зазвичай застосовують А1і-поліморфізм, відсутній у миші), уточнити, які фрагменти певної хромосоми людини збереглися в радіаційних гібридах. Ще однією особливістю радіаційних гібридів є те, що на них можна вивчати зчеплення між генами у фрагментах хромосом людини і навіть оцінювати генетичне відстань між зчепленими локусами, виходячи з того, наскільки часто вони присутні у фрагментах разом або окремо. При цьому припускають, що чим ближче розташовані гени один до одного на хромосомі, тим рідше радіаційно індуковані розриви в хромосомі будуть розділяти зчеплені гени.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

4.4. Одержання α-лейкоцитарного  інтерферону

 

 

Перші спроби отримати інтерферони  здійснено у середині 50-х років XX ст. Тоді з клітин периферичної крові  людини, активованих вірусом Сендай, виділили альфа-інтерферон. Однак таким способом можна було отримати невеликі кількості інтерферону, непридатні для широкомасштабного клінічного використання.

Нині застосовують два  способи: генно-інженерний, коли альфа-інтерферон експресується культурою клітин Escherichia coli, трансформованої вектором, у який вбудовано послідовність ДНК, що кодує зрілий білок, та отримання інтерферонів у культурі лімфобластойдних клітин [24]. За цим способом грубий матеріал із культури лімфобластойдних клітин, попередньо активованих вірусом Сендай, очищали на імунохроматографічних колонках (імуноафінна хроматографія з моноклональними антитілами, специфічними до альфа-інтерферону). У зв'язку з використанням для вироблення інтерферону лімфобластоїдних клітин виникло кілька запитань з приводу можливості використання трансформованих клітин у біотехнологічних процесах одержання медичних препаратів. Деякі лінії, особливо отримані з клітин є злоякісними. Використання трансформованих клітинних ліній, особливо пухлинного походження, для вироблення медичних препаратів було вперше застосовано саме для виробництва альфа-інтерферону. Питання про можливість використання таких препаратів широко обговорювалося, але нині загальновизнано, що перещеплювальні лінії можна використовувати для виробництва фармацевтичних препаратів при достатньому очищенні кінцевого продукту та за умови дотримання певних вимог [25]. Ці вимоги стосуються клітин, що використовуються як субстрат готового очищеного продукту, та методу очистки. Щодо методу, то має бути доведено, що при цьому елімінуються або інактивуються будь-які дійсно або потенційно шкідливі домішки, які наявні у неочищеному продукті. Особлива увага приділяється контролю у процесі виробництва і стабільності параметрів виробничого процесу. Система GMP (good manufacturing practice) формалізує ці вимоги [25]. Вона застосовується в усіх біологічних виробництвах. Крім того, існує необхідний контроль активності, ідентичності, чистоти, токсичності, пірогенності і стерильності готового препарату. Особливу увагу при одержанні інтерферонів з культур лімфобластоїдних клітин слід звертати на можливу присутність у готовому продукті таких домішок:

- біологічно активних  сторонніх агентів (ДНК, білки,  сторонні інфекційні агенти, ендогенні  ретровіруси). Ці агенти можуть  бути в неочищеному препараті,  але не в готовому продукті;

- матеріалів з культурального  середовища, речовин, які використовують  для підсилення продукції інтерферону,  індукторів інтерфероногенезу, а  також речовин, що використовувались  для очищення препарату.

Одразу після отримання  перших партій штучного альфа-інтерферону  почались дослідження щодо можливості його використання для лікування  онкологічних захворювань.

Препарати інтерферону, отримані за участі вірусу Сендай:

Егіферон (Угорщина) - суміш  підтипів альфа-інтерферонів, одержуваних  після обробки лейкоцитів людини вірусом Сендай. Випускається в ампулах  по 3 млн ME або у вигляді мазі в  тубах по 2 р. Призначений для ін'єкцій  або місцевого використання.

Велферон (Англія) - людський лімфобластний інтерферон - суміш  підтипів альфа-інтерферонів, що продукуються лімфобластними клітинами, зараженими вірусом Сендай.

 

 

 

4.5. Використання  вірусу Сендай як вірусного  вектора

 

 

Векторами (в генетиці) називають  молекулу нуклеїнової кислоти, найчастіше ДНК, що використовується в генній інженерії  для передачі генетичного матеріалу  іншій клітин [18].

Вектори що використовуються для генної терапії мають фундаментальну проблему: вони мають увійти в ядро щоб вивільнити гени, які вони несуть. В ядрі деякі вектори вбудовуються в хромосому(інтеграція), а інші призводять до генетичної рекомбінації хромосомної ДНК [27]. Наявні поодинокі повідомлення, про несприятливі явища (лейкемія), викликані використанням ретровірусів. Також відомо, що в деяких випадках, аденовірусні вектори можуть спричинити незворотні зміни в структурі хромосом на  місці інтеграції. Відповідно важливою стала оцінка ризиків пацієнтів перед використанням цих векторів у пацієнтів.

F білок

На противагу їм вектор вірусу Сендай відтворює свій геном виключно в  цитоплазмі, утворюючи при цьому  велику кількість білку(рис.4.3). Він не проникає до клітинного ядра. Більше того його геном побудований з РНК, матеріалу що хімічно відрізняється від ДНК пацієнта. Векторні препарати на основі вірусу Сендай ефективні в малих дозах і потребують менше 5 хвилин взаємодії з клітиною, щоб передати їй свої гени [27]. 

сіалова кислота

NH білок

клітинна мембрана

 

Рисунок 4.3- Взаємодія вірусу Сендай з клітиною.

1 -  Приєднання NH білку до сіалової кислоти мембрани; 2 – F білок спричиняє злиття вірусу і мембрани; 3 – Проникнення генетичного матеріалу в цитоплазму [27].

цитоплазма

5. Методи одержання  та інактивації вірусу Сендай

 

5.1. Одержання

 

5.1.1. Метод 1

 

 

Вірус Сендай вирощують в  алантоїсній порожнині курячих  яєць. Метод вирощування описано  Харрісом і Уоткінсом [28].

• Отримати заражену алантоїсну рідину, що містить вірус Сендай в концентрації 8000 ГАО/мл і розвести її ФСБ в співвідношенні 1: 10⁴.
• Ін'єктувати 0,1 мл в аллантоїсну порожнину курячих яєць на 10-11-й день після запліднення.
• Інкубувати протягом 3х діб при 37°С і потім протягом ночі при 4°С.
• Зібрати аллантоїсну рідину і центрифугувати при 400 g протягом 10хвилин.
• Визначити титр гемагглютації
• Центрифугувати при 30 000g протягом 30 хв і суспендувати осад в 1/10 вихідного об'єму СБСР Хенкса.
• Зберігати при - 70°С.

 

 

5.1.2. Метод 2

 

 

Запліднені яйця курей (білих  леггорнів) розміщують на 11 днів в інкубатор (38,5°С, відносна вологість 80 - 90%, перевертання кожні 3-4 год) [29].

Переглядаючи яйця на просвіт, відзначають на шкаралупі те місце, проти якого розташована вільна від судин пляма поблизу головної пупкової артерії. Шкаралупу над  цією плямою видаляють зуболікарським бором, роблячи отвір діаметром 2 - 3 мм, що оголює оболонку шкарлупи (пошкодження  цієї оболонки, що виявляється по кровотечі, призводить до інфікування яйця; такі яйця не слід використовувати). Яйця розміщують на лоток і ділянку шкаралупи  близько 2 см в діаметрі з просвердленим  отвором в центрі стерилізують, змащуючи її гарячим парафіном (точка плавлення 58-65°С; розігрівають приблизно до 120 ° С, тобто трохи нижче температури  утворення диму).

На парафінову поверхню наносять 0,05 мл фізіологічного розчину, що містить 10² -10³ ID₅₀ вірусу Сендай. Шкарлупову оболонку проколюють голкою, простерилізованою над полум'ям. Інокулюм всмоктується в порожнину аллантоїса, де є негативний тиск. Після цього отвір запечатують, протираючи тампоном, змоченим гарячим парафіном.

Яйця розміщають на лотки  повітряним пузирем (тобто тупим  кінцем) вгору і тримають в звичайному термостаті протягом 3 днів (68-72 год) при 35°С. Після цього їх охолоджують (залишивши при 4 ° С на ніч або  щонайменше на 3 години), щоб зупинити кровообіг і таким чином запобігти  кровотеча при зборі вірусу.

Перед збором вірусу шкаралупу  над повітряним міхуром розламують і видаляють. Проколовши оголену  мембрану і посунувши ембріон  в сторону за допомогою стерильного  пінцета, стерильною пастерівською  піпеткою (з коротким капіляром і  бажано з широким отвором) відсмоктують аллантоісну рідину. В середньому отримують близько 10 мл рідини з  одного яйця зі значними індивідуальними  коливаннями. Потрібно старатися не пошкодити амніон і жовтковий  мішок і не проникнути в яєчний білок, так як при цьому може забруднитися зібрана алантоїська рідина.

5.1.3.  Титрування  вірусу

 

 

В зразках аллантоісної рідини перед їх об'єднанням і інактивацією титрують вміст вірусу, використовуючи реакцію гемаглютинації [29].

Згідно зі стандартизованою методикою, цю реакцію проводять  або в круглодонних пробірках  діаметром 12 мм, або (краще) на панелях  для гемаглютинації, рекомендованих ВОЗ (8 рядів по 10 лунок зі сферичним  дном). У першу пробірку вносять 0,5 мл, а в інші 9 пробірок - по 0,25 мл фізіологічного розчину. У першу пробірку додають 0,05 мл аллантоїсної рідини (тобто початкове  розведення 1:11, або 1,04 в логарифмічних  одиницях); потім, переносячи по 0,25 мл з  лунки в лунку, роблять серію  дворазових розведень в інтервалі  від 1: 11 до 1:5632 (від 1,04 до 3,75 логарифмічних  одиниць). Після цього в кожну  лунку вносять по 0,025 мл 5%-ної суспензії  курячих еритроцитів у фізіологічному розчині. Панелі струшують і переносять в холодильник при 4°С. Через 20 хв їх струшують повторно. Реакцію враховують після 40 хв інкубації при 4°С.

При відсутності аглютинації (-)еритроцити, що осіли, утворюють на дні лунки щільний ґудзичок, тоді як при повній аглютинації (+ +) вони тонким рожевим шаром покривають все дно. За кінцеву точку титрування умовно приймають таку ступінь аглютинації (+), при якій діаметр осаду еритроцитів  становить одну третину діаметра лунки. Інтерполюючи до цієї кінцевої точки, реакцію можна врахувати  з точністю +0,033 логарифмічною одиниці (± 8%); якщо ж за кінцеву точку титрування прийняти останню пробірку з повною аглютинацією, то помилка методу зросте до ± 0,27 логарифмічних одиниць (± 86%).

Якщо титрування проводять  на панелях мікротитратору (в обсязі 0,025 мл; перший розведення 1:2), концентрацію суспензії еритроцитів зменшують  до 1% суміш інкубують двічі по 20 хв при 4°С. Помилка методу при цьому  не менше ± 0,2 логарифмічних одиниць (± 58%).

 

 

5.1.4. Розрахунок  титру

 

 

Одна гемоаглютаційна  одиниця (ГАО) – це така кількість  віруса, яка спричиняє аглютинацію (+) в 1 мл 1%-ної суспензії курячих  еритроцитів. Ця одиниця відповідає приблизно 4·10⁷ (7,6 логарифмічних одиниць) вірусним частинкам [30].