Автор работы: Пользователь скрыл имя, 04 Октября 2013 в 19:16, курсовая работа
Вірус Сендай належить до сімейства параміксовірусів, є патогенним для мишей, хом’яків, морських свинок і викликає в них легеневу пневмонію. В лабораторній практиці він широко застосовується як ініціатор гібридизації тваринних клітин.
Актуальність дослідження даного вірусу полягає в його структурній і функціональній подібності до інших представників сімейства параміксовірусів, які викликають захворювання у людей. А також в пошуку нових шляхів практичного застосування властивостей даного вірусу.
ВСТУП 4
ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ 5
Історія відкриття вірусу Сендай 5
Морфологія вірусу сендай 7
Зовнішня будова 7
Ліпідна оболонка 9
Організація генома та вірусні білки 10
Нуклеокапсид 11
Вірусна РНК 12
Білок F 12
Білок NP 13
Білки M та NH 13
Білоки L та P 14
Реплікація вірусу Сендай 15
Приєднання вірусу до клітинної поверхні і його проникнення у клітину 15
Транскрипція і трансляція 16
Реплікація РНК 19
Генетичні взаємодії 20
Практичне використання вірусу Сендай в медицині та біотехнології 22
Історія виникнення методів гібридизації клітини 22
Механізм злиття клітин 24
Гібридизація соматичних клітин і картування
генів людини 28
Одержання α-лейкоцитарного інтерферону 31
Використання вірусу Сендай як вірусного вектора 33
Методи одержання та інактивації вірусу Сендай 34
Одержання
Метод 1 34
Метод 2 34
Титрування вірусу 36
Розрахунок титру 37
Інактивація 38
Інактивація ультрафіолетом 38
Інактивація β-пропілактоном 39
Інші методи інактивації 40
Метод злиття клітин нирок хом’яка з 41
еритроцитами курей
ВИСНОВКИ 42
ЛІТЕАТУРА 43
Структурні субодиниці орієнтовані не перпендикулярно до осі спіралі, а під кутом приблизно 60° [7]. Така орієнтація сприяє утворенню вигинів, необхідних для укладання нуклеокапсида у внутрішню порожнину вірусної частинки, обмежену мембраною, так-як довжина порожнини приблизно в 5 разів менша довжини осі нуклеокапсида.
Форма субодиниць у вигляді м’яча для регбі також зручна для утворення вигинів. Розміри структурних субодиниць, більший діаметр — 5,5-7 нм і менший – 2,5 нм, нагадують розміри субодиниць вірусу та бачної мозаїки[6].
Характеристики густини нуклеокапсидів сильно варіюють. В розчинах хлориду цезію густина їх склала 1,29—1,38 г/см3 [3]. Такий широкий діапазон значень, очевидно, обумовлений неповним видаленням суперкапсидних і мембранних білків вібріона під час отримання нуклеокапсида.
2.3.2. Вірусна РНК
Віріон містить РНК, білки, ліпіди і вуглеводи. РНК складає від 0,5 до 3% від сухої маси вібріона. Коефіцієнт седиментації РНК вірусу Сендай складає 50S. Молекулярна маса РНК складає 5,4·106. Визначення нуклеотидного складу РНК параміксовірусів показало деяку перевагу піраміди нових основ над піридиновими, а саме уридилових залишків. В складі віріону було виявлено в основному «мінус-нитки», з якими пов’язана генетична інформація, однак, зустрічаються також вібріони, що містять «плюс-нитки» [4].
2.3.3. Білок F
Білок F вірусу Сендай, що викликає злиття мембран, синтезується у вигляді неактивного попередника F0, активуючого ся у результаті розщеплення на 2 фрагменти — F1 та F2 [7]. Розщеплення супроводжується конфірмаційними змінами, що приводять до підвищення гідрофобності глікопротеїна. Необхідність протеолітичної активації може обмежити коло хазяїнів вірусу лише такими тканинами в яких містяться відповідні протеази [3]. Пригнічення злиття мембран за допомогою синтетичних пептидів, які мають схожу до гідрофобного N-кінця білка F1 послідовність амінокислот, свідчить про активність даної ділянки. Білок вірусу Сендай, що викликає злиття мембран, відрізняється від відповідних білків вірусів інших сімейств тим, що він активний у позаклітинному середовищі. Він викликає злиття клітин, що веде до утворення синцитія.
2.3.4. Білок NP
Для вивчення білку NP його було виділено з вірусного нуклеокапсиду, що знаходився в інфікованій вірусом Сендай клітині печінки хом’яка, і використано як розчин для дослідження умов синтезу РНК [8]. З підвищенням концентрації NP швидкість декапсидації і синтезу РНК лінійно збільшувалася. Були зроблені висновки про здатність нуклеокапсидного білка сприяти in vitro синтезу і декапсидації РНК вірусу Сендай під час її реплікації. Була також розроблена модель Ламба-Колаковскі згідно якої на лідируючій РНК є спеціальний сайт для утворення РНК-NP комплексу, який створює сигнал для декапсидації.
2.3.5. Білки М та NH
Мембранний білок вірусу Сендай М є надзвичайно важливим для складання вірусу та брунькування, він взаємодіє з вірусним глікопротеїном з зовнішньої сторони і вірусним нуклеокапсидом з внутрішньої. Використання рекомбінантних вірусних вакцин для створення штучних комбінацій білків M,F та NH дозволило встановити, що лише невелика частина білка М (8-16%), може бути зв’язана з мембраною за відсутності глікопротеїну, в той час як при наявності обох F та NH білків такий зв'язок становить 75%[9]. Наявності лише одного глікопротеїну достатньо щоб спровокувати зв'язок М білку з мембраною на 56-73%.
HN-білок – глікопротеїн,
що забезпечує прикріплення
2.3.6. Білки L і Р
Великий (близько 2200 амінокислотних
залишків), L-полімеразний білок вірусі
Сендай має шість окремих незалежних
ділянок (доменів), які слугують для
підтримки специфічної
Білок Р виконує стабілізуючу роль в синтезі вірусної РНК, підтримуючи її зв'язок з нуклеокапсидом з утворенням відповідної асоціації. Існують докази того, що за цю асоціацію відповідальні дві окремі ділянки білка Р [12].
Таким чином, морфологічно вірус Сендай являє собою сферичний вірус зі спірально-симетричним нуклеокапсидом, утвореним нуклеокапсидним NP білком, і оточеним ліпопротеїдною оболонкою, вкритою довгими глікопротеїдними шипикаим, бобудованими з білків F та NH.
3. РЕПЛІКАЦІЯ ВІРУСУ СЕНДАЙ
3.1. Приєднання вірусу до клітинної поверхні і його проникнення у клітину
Про поверхневі глікопротеїни параміксовірусів відомо набагато менше, ніж про НА і NА віруси грипу. Пояснюється це тим, що з медичної точки зору наслідки грипозної інфекції (особливо в період величезної епідемії 1918 - 1919 рр.) набагато серйозніші, ніж наслідки тривіальної параміксовірусної. Ця обставина стимулювало більш інтенсивне вивчення вірусів грипу. Крім того, поверхневі білки параміксовірусів в антигенному відношенні набагато стабільніші, тому в людських популяціях особи старшого віку майже завжди імунізовані. Білок HN (hemagglutinin-neuraminidase) здійснює прикріплення вірусу до клітини; при цьому важливим компонентом глікопротеїнового рецептора є сіалова кислота. Присутність в тій же молекулі нейрамінідазної активності не тільки відрізняє її від глікопротеїнів вірусу грипу, але й вказує на топографію взаємодії між активним центром нейромінідази і сайтом зв'язування гемаглютиніна.
Другим етапом зараження є злиття оболонки віріона з клітинною мембраною. У параміксовірусів цей процес здійснюється іншим глікопротеїном F. Форма-попередник F0 поза клітини піддається протеолітичному розщепленню на велику субодиницю F1, яка містить новий гідрофобний N-кінець, що проникає в клітинну мембрану, і меншу нефункціональну субодиницю F2, пов'язану з F1 дисульфідним містком [13] . Викладене вказує на еволюційну зв'язок між вірусом Сендай і вірусом грипу. На цьому, втім, аналогія між ними закінчується. Віріони вірусу грипу потрапляють в клітину в складі ендосом - внутрішньоклітинних везикул з низьким значенням рН, що змінює конформацію НА і полегшує впровадження субодиниці НА2 в мембрану везикули. При нейтральних значеннях рН, характерних для міжклітинного простору, злиття з мембраною не відбувається. Що стосується вірусу Сендай з розщепленим F-білком, то він здійснює злиття мембран навіть в таких умовах і саме тому часто використовується як агент, що стимулює злиття клітин, при отриманні клітинних гібридів. Таким чином, вірус Сендай та інші параміксовіруси проникають у клітину безпосередньо через клітинну мембрану, без посередництва ендосом, необхідних для проникнення вірусу грипа [3].
3.2. Транскрипція і трансляція
Стратегія реплікації вірусів з негативним геномом була виявлена при вивченні параміксовірусу: курячого вірусу ньюкаслської хвороби (NDV) [6]. Як і вірус Сендай, NDV містить високомолекулярну одно ланцюгову геномну РНК з мол. масою близько 5·106, що істотно перевищує розмір індивідуального сегмента РНК вірусу грипу. Вивчення NDV-специфічних РНК, синтезованих в зараженій клітині, показало, що мол. маса більшості з них не перевищує 1·106, тобто вони є вірусними мРНК. Молекули РНК, які мають розмір генома, представлені істотно меншим числом копій. Аналіз нуклеотидного складу РНК-геному NDV виявив високий вміст уридиловихвих залишків, в той час як передбачувані мРНК характеризуються високим вмістом залишків аденіну. Це обставина дозволяє припустити, що молекули цих двох класів комплементарні; гіпотеза отримала підтвердження в дослідах по гібридизації in vitro [14]. Крім того, РНК меншого розміру, комплементарні геномній РНК, транслювалися in vitro з утворенням вірусних білків, тобто виявилися істинними мРНК. Пізніше виявилося, що подібну стратегію використовує вірус везикулярного стоматиту (VSV) - представник сімейства рабдовірусів [14]. Оскільки в культурі клітин VSV реплікується більш ефективно, ніж будь-який з параміксовірусів а його віріони містять набагато більш активний і доступний для експериментів in vitro апарат транскрипції, фундаментальні аспекти біології VSV вивчені краще, ніж у параміксовірусів .
Рисунок 3.1 - Структура генома Сендай. Відмічені положення генів позитивної лідируючої РНК(+) і регуляторних елементів транскрипції на меж генів. Літерами Е, І та S позначено відповідні кінці (включаючи сигнал поліаденілювання), міжгенні ділянки і стартові послідовності [6].
Консенсус
Початок гену NP
Кінець гену L
Транскрипція вірусу Сендай, відрізняється від транскрипції сегментів РНК вірусу грипу за своєю цитоплазматичної локалізацією і відповідно за здатністю РНК-полімерази ініціювати транскрипцію при відсутності екзогенної затравки і кепіювати і метилювати 5'-кінець транскрипту. Оскільки гени вірусу Сендай тандемно зчеплені в складі єдиного ланцюга РНК (рис. 3.1), однієї оліго-уріділової послідовності недостатньо для термінації транскрипції. Транскрипційні комплекс вірусу грипу може пізнавати 5'-кінець кожного сегмента, віддалений на 13 - 17 нуклеотидів від олігоуріділової послідовності, як складову частину сигналу термінації. У вірусу Сендай, олігоуридилова ділянка, що ініціює 3'-кінцеві поліаденіліювання, передується специфічним тетрануклеотидом (AUUC) [13]. Слідом за oligo(U) йдуть міжгенні олігонуклеотиди, що не експресуються, GAA, а далі - консервативний сигнал ініціації синтезу мРНК довжиною близько 10 нуклеотидів.
Інші особливості транскрипції у вірусів Сендай: полярність, що виявляється в тому, що близькість гена до 3'-кінця генома визначає ефективність його транскрипції [14], функція 50-нуклеотидної лідируючої послідовності, комплементарної 3'-кінцю генома, а також відсутність трансляційного контролю за кількістю вірусних білків.
В гені, що кодує Р-білок, асоційований з полімеразною активністю вірусу Сендай, присутня друга відкрита рамка зчитування. Вона кодує невеликий неструктурний білок, названий білком С, і цілком розташована всередині гена Р. Але на відміну від транскрипції сьомого та восьмого сегментів РНК вірусу грипу, коли сплайсинг приводить до утворення мРНК різних класів, у даному випадку окрему мРНК для білка С не виявлено. Передбачається, що одна і та ж мРНК транслюється з утворенням двох альтернативних білків [13].
Про функції нуклеокапсідний білків вірусу Сендай в регуляції транскрипції відомо небагато. L-Білок, близький аналог білка L VSV, має достатні розміри, щоб виконувати функцію РНК-полімерази, і містить активний центр цього ферменту здатний до кепіювання і метилювання. Білок P у віріонах вірусу Сендай фосфорильовано найбільшою мірою [12] і є аналогом фосфопротеїнів NS VSV, тобто поряд з L - білком бере участь в синтезі РНК. Білок NР не має каталітичної активності, його здатність зазнавати конформаційних змін повинна в процесі зчитування матриці РНК-полімеразою полегшувати розтягування спіралі.
3.3. Реплікація РНК
Механізм, що перемикає транскрипцію мінус-ланцюгів на їх реплікацію, принципово важливий, але до сих пір погано вивчений. Транскрипція сегментів РНК закінчується на відстані більше 10 нуклеотидів від кінця матриці. Тому в ході реплікативного синтезу ключову роль відіграє антитермінація, що дозволяє РНК-полімеразі копіювати oligo (U)-сигнал ініціації поліаденілювання і наступні нуклеотиди. Для РНК-вмісних вірусів з несегментованим негативним геномом антитермінація в ході реплікативного синтезу є серйозною проблемою. Справа в тому, що для синтезу проміжної матриці - позитивного антигенома - РНК-полімераза не повинна звертати увагу на сигнальні послідовності на кордоні «лідер - ген NР», а крім того, на кордоні всіх наступних вірусних генів [14]. Еволюційна консервативність сигналів термінації транскрипції у вірусу Сендай вказує на важливість цих нуклеотидних послідовностей для РНК-полімераз. Однак, щоб зрозуміти механізми взаємодії сигнальних послідовностей з комплексом полімеразних білків, необхідна більш повна інформація про структуру і функціональні можливості білків Р і L [11].
Ініціація синтезу РНК, чи то реплікація чи транскрипція, має на увазі наявність на 3'-кінці негативної геномної РНК певних сигнальних послідовностей. Тут виявлено кілька ділянок гомології між РНК VSV і вірусу Сендай. Крім того, можна виявити ще кілька гомологічних ділянок, вносячи необхідні делеції або вставки [15]. Відповідно до цих гомологій лідируюча РНК обох вірусів збагачена U і збіднена О та С. Беручи до уваги також гомології в термінуючих і міжгенних послідовностях, можна вважати, що VSV і вірус Сендай походять від спільного родоначальника.
3.4. Генетичні взаємодії
Віруси з несегментованим негативним геномом характеризуються набагато меншою мінливістю, ніж віруси грипу. Одна з причин цього досить очевидна: несегментованість геному робить неможливими пересортовування і перегрупування, що призводять у вірусу грипу до появи нових, доступних для тестування і відбору генних комбінацій. Звичайно, рекомбінація, заснована на механізмі зміни матриць, як і раніше можлива, і не лише внутрішньогена, а й між генна [15].
Для вірусу грипу характерний високий рівень мінливості; особливо сильно вона виражена в тих ділянках третинної структури, де амінокислотна ланцюг утворює петлю, яка виступає зі структури. Навпаки, за довгі роки не виявлено жодних істотних змін в білках НN і Р вірусу Сендай і параміксовірусів, про що, зокрема, свідчить наявність стійкого імунітету після інфекції або вакцинації вірусами кору та паротиту [16]. Незначні зміни, звичайно ж, накопичуються і можуть бути виявлені за допомогою чутливих зондів, наприклад моноклональних антитіл. Але такі зміни, які допомогли б вірусу обійти імунологічний контроль з боку господаря, як це періодично робить вірус грипу, у параміксовірусів не виявлені.