Анализ крови туберкулезного больного

Наиболее распространённый метод для выявления кислотоустойчивых  микобактерий в мазке - окраска по Цилю-Нельсену. Метод основан на проникновении карболового фуксина  в микробную клетку через мембрану, включающую в себя восково-липидный слой, при одновременном воздействии  нагревания и сильного протравливающего действия фенола. Последующее обесцвечивание мазка 25% раствором серной кислоты  или 3% солянокислым спиртом приводит к обесцвечиванию всех некислотоустойчивых  структур. Обесцвеченные элементы мазка  докрашивают 0,3% раствором метиленового синего. Микобактерии не воспринимают обычные анилиновые красители, в  результате чего кислотоустойчивые  микобактерии окрашиваются в малиново-красный  цвет, а другие микробы и клеточные  элементы - в голубой.

Для исследования мазков, окрашенных по Цилю-Нельсену, используют световой бинокулярный микроскоп с  иммерсионным объективом (90- или 100-кратное  увеличение) и окуляром с 7- или 10-кратным  увеличением. Исследуют 100 полей зрения, что достаточно для выявления  в мазке единичных микобактерий. В том случае, если результат такого исследования отрицательный, для подтверждения  рекомендуют просмотреть еще 200 полей  зрения. Регистрируют результаты, указывая количество обнаруженных кислотоустойчивых  микобактерий (КУМ).

Помимо данной методики, применяют окраску флюорохромами  для люминесцентной микроскопии, что  позволяет достичь наилучших  результатов. Применение этого метода повышает эффективность микроскопии  на 10-15%. При обработке микобак-терий  люминесцентными красителями (аурамин, родамин и др.) эти вещества также  связываются с воскоподобными структурами  микробной клетки. При облучении  окрашенных клеток возбуждающим источником света (определённый спектр ультрафиолетового  излучения) они начинают светиться  оранжевым или ярко-красным светом на черном или тёмно-зелёном фоне. В связи с высокой яркостью и контрастностью видимого изображения  можно снизить общее увеличение микроскопа в 4-10 раз, чем расширяется  поле зрения и уменьшается время  просмотра препарата. Наряду с этим за счёт значительно большей глубины  резкости можно повысить комфортность исследования.

При использовании  флюоресцентной микроскопии на просмотр той же площади мазка затрачивают  значительно меньше времени, чем  при световой микроскопии мазков, окрашенных по Цилю-Нельсену. Если за рабочий  день микроскопист просматривает примерно 20-25 таких мазков, то с помощью  флюоресцентной микроскопии он может исследовать за то же время более 60-80 образцов. Опытные микроскопист знают, что окраска клеток смесью аурамина и родамина является в некотором роде специфической для кислотоустойчивых микобактерий, которые в этом случае имеют вид золотистых палочек. Сапрофиты окрашиваются в зеленоватый цвет.

Другое важное преимущество метода флюоресцентной микроскопии - возможность  обнаруживать изменённые микобактерии, утратившие под влиянием ряда неблагоприятных  факторов, в частности интенсивной  химиотерапии, свойство кислотоусотойчивости и не выявляющиеся в связи с  этим при окраске по Цилю-Нельсену.

К недостаткам метода флюоресцентной микроскопии относят  сравнительно высокую стоимость  микроскопа и его эксплуатации. Однако в централизованных или других крупных  лабораториях, где нагрузка превышает  норму 3 лаборантов, работающих с тремя  обычными микроскопами, дешевле использовать вместо этого один флюоресцентный микроскоп.

Бактериоскопические методы обладают довольно высокой специфичностью (89-100%). Около 97% положительных результатов, полученных любым методом микроскопии, однозначно подтверждаются результатами посева.

Необходимо отметить, что при микроскопическом исследовании мазка патологического материала  нельзя определить видовую принадлежность выявленных кислотоустойчивых микобактерий. Метод микроскопии позволяет  дать заключение лишь о наличии или  отсутствии в препарате кислотоустойчивых  микроорганизмов, что объясняется  существованием в природе большого числа морфологически сходных с  микобактериями туберкулёзного комплекса  нетуберкулёзных кислотоустойчивых  микроорганизмов.

Оценку результатов  микроскопии производят в полуколичественных единицах.

Для того чтобы можно  было сравнивать результаты различных  методов микроскопии, вводят эмпирические коэффициенты. Например, чтобы сопоставить  результаты исследования мазка, окрашенного  флюоресцентными красителями, с  данными исследования световой микроскопии (1000-кратное увеличение), необходимо разделить количество кислотоустойчивых  микобактерий, обнаруженных с помощью  люминесцентного микроскопа, на соответствующий  коэффициент при 250-кратном увеличении микроскопа - на 10, при 450-кратном - на 4, при 630-кратном - на 2.

Особенности микроскопии при внелегочном  туберкулезе

Осуществляют прямую микроскопию, а также микроскопию  мазков, приготовленных после обогащения с последующей окраской по Цилю-Нельсену или люминесцентными красителями. Прямая микроскопия мазков малоэффективна в связи с низкой концентрацией  микобактерий в материале, а потому рациональнее использовать методы обогащения. Наиболее эффективно центрифугирование. Если биологический материал вязкий, применяют центрифугирование с одновременной гомогенизацией и разжижением материала, которое проводят с помощью высокооборотных центрифуг с силой центрифугирования 3000 g и растворов гипохлорита. Другие методы обогащения, например микрофлотацию, в настоящее время не используют из-за образования биологически опасных аэрозолей.

Культуральный метод диагностики туберкулеза

Метод посева, или  культуральный метод, отличается большей  чувствительностью, чем микроскопия  мазков, и имеет перед последним  ряд преимуществ. Он позволяет обнаруживать несколько десятков жизнеспособных микобактерий в исследуемом материале  и имеет большую диагностическую  ценность. Это особенно важно при  исследовании материала от впервые  выявленных или леченных больных, выделяющих небольшое количество микобактерий.

По сравнению  с микроскопией, культуральное исследование позволяет увеличить число выявленных больных туберкулёзом более чем  на 15-25%, а также верифицировать туберкулёз в более ранних стадиях, когда  заболевание ещё хорошо поддаётся  лечению. Очень важным преимуществом  культурального исследования считают  возможность получения культуры возбудителя, которая может быть идентифицирована и изучена в  отношении лекарственной чувствительности, вирулентности и других биологических  свойств.

К недостаткам методов  культивирования следует отнести  их длительность (срок ожидания материалов достигает 10 нед). более высокую стоимость, сложность обработки диагностического материала.

Принципы  предпосевной обработки диагностического материала

Обычные микробиологические методики не могут быть использованы при проведении исследований на туберкулёз. Это связано с тем. что растут микобактерии туберкулёза очень  медленно, а большинство проб клинического материала содержит быстрорастущие гноеродные и гнилостные микроорганизмы, грибы. Их бурный рост на богатых питательных  средах мешает развитию микобактерий и не позволяет выделить возбудителя  туберкулёза, поэтому перед посевом  диагностический материал обязательно  подвергают предварительной обработке. Кроме того, микобактерии, выделяющиеся из дыхательных путей больного, как  правило, окружены большим количеством  слизи, затрудняющей их концентрирование. В связи с этим перед посевом  мокроты и других сходных материалов необходимо их разжижение, деконтаминация.

Все детергенты и  деконтаминанты обладают более или  менее выраженным токсическим действием  на микобактерии. В результате обработки  может гибнуть до 90% микобактерий. Чтобы сохранить достаточную  часть микобактериальной популяции, необходимо использовать щадящие методы обработки, позволяющие, с одной стороны, подавить быстрорастущие гноеродные и гнилостные микроорганизмы, а с другой - максимально сохранить жизнеспособность присутствующих в материале микобактерий.

В зависимости от материала, степени его гомогенности и загрязнённости для предпосевной обработки используют различные  деконтаминанты: для мокроты - раствор  гидроксида натрия 4%, растворы трёхзамещённого  фосфорнокислого натрия 10%, бензалкониума  хлорида тринатрий фосфата, NALC-NaOH (N-ацетил-L-цистеин-гидроксид натрия) с конечной концентрацией NaOH 1%, для  мочи и других жидких материалов - раствор  серной кислоты 3%, для загрязнённых проб, жиросодержащих материалов - раствор  щавелевой кислоты до 5%. Кроме  того, в некоторых случаях используют ферменты, поверхностно-активные вещества (детергенты). Применение твина и  некоторых других детергентов сопровождается меньшей гибелью микобактериальных  клеток (выживают 40-50%). однако использовать их можно только для жидких материалов. Наибольшее распространение в мире получил NALC-NaOH. выпускаемый в наборах. Этот метод позволяет выделять более 85% популяции клеток микобактерий. Деконтаминация тканесодержащих твёрдых материалов труднее, поскольку угадать степень  дисперсности материала в процессе гомогенизации сложно. Например, обработка  биоптатов лимфатических узлов  нередко сопровождается повышенной частотой контаминации посторонней  флорой. В этом случае можно использовать 1% этоний.

Негомогенный материал гомогенизируют с помощью стеклянных бус в присутствии деконтаминантов. Жидкие материалы предварительно центрифугируют и обработке подвергают только осадок.

Техника посева и инкубации

После предварительной  обработки материал центрифугируют, за счёт этого осаждают микобактерии и повышают их содержание в осадке («обогащение осадка»). Полученный осадок подвергают нейтрализации и засевают им (инокулируют) поверхность плотных  питательных сред или пробирки с  жидкими (полужидкими) средами. Из оставшейся части осадка готовят мазки для  микроскопического исследования. Техника  посева должна предотвращать кросс-контаминацию диагностического материала.

Для достоверной  клинической интерпретации результатов  микробиологического исследования необходимо соблюдать следующее  правило: микроскопическое и культуральное  исследования нужно производить  параллельно из одной и той  же пробы диагностического материала.

Инокулированные пробирки помещают в термостат при 37 ^oС на 2 сут в горизонтальном положении. Это обеспечивает более равномерное всасывание материала в питательную среду. Через 2 сут пробирки переводят в вертикальное положение и герметично закрывают резиновыми или силиконовыми пробками во избежание подсыхания засеянных сред.

Посевы выдерживают  в термостате при 37 ^оС в течение 10-12 нед при регулярном еженедельном просмотре. При каждом контрольном просмотре регистрируются следующие параметры:

• срок визуально наблюдаемого со дня посева роста;
• интенсивность роста (число КОЕ);
• загрязнение посева посторонней микробной флорой или грибами (такие пробирки удаляют);
• отсутствие видимого роста. Пробирки оставляют в термостате до следующего просмотра.

Питательные среды

Для культивирования  микобактерий используют различные  питательные среды; плотные, полужидкие, жидкие. Однако ни одна из известных  питательных сред не обладает свойствами, обеспечивающими рост всех микобактериальных  клеток. В связи с этим для повышения  результативности рекомендуют применять  одновременно 2-3 питательные среды  разного состава.

В качестве стандартной  среды для первичного выделения  возбудителя туберкулёза и определения  его лекарственной чувствительности ВОЗ рекомендует среду Левенштейна-Йенсена. Это плотная яичная среда, на которой  рост микобактерий получают на 20-25-й  день после посева бактериоскопически положительного материала. Посевы бактериоскопически отрицательного материала требуют  более длительного периода инкубации (до 10-12 нед).

В нашей стране широкое  распространение получила предложенная Э.Р. Финном яичная среда Финн-II. Она  отличается тем, что вместо L-аспарагина в ней используют глутамат натрия, запускающий иные пути синтеза аминокислот  микобактерий. Рост появляется на этой среде несколько раньше, а частота  выделения микобактерий на 6-8% выше, чем на среде Левенштейна-Йенсена.

Для повышения эффективности  бактериологической диагностики внелёгочного туберкулёза целесообразно включать в комплекс питательных сред модифицированные среды Финн-II. Для ускорения роста  в питательную среду Финн-II дополнительно  вводят натрий тиогликолат 0,05%, снижающий  концентрацию кислорода. Для защиты ферментных систем микобактерий от токсичных  продуктов перекисного окисления  липидов в питательную среду  Финн-II вводят антиоксидант α-токоферола ацетат в концентрации 0,001 мкг/мл. Посев  диагностического материала производят по стандартной методике.

В противотуберкулёзных лабораториях России используют и другие модификации плотных питательных  сред; предложенную Г.Г. Мордовским питательную  среду «Новая», разработанные В.А. Аникиным питательные среды А-6 и  А-9 и др.