Анализ крови туберкулезного больного

В 2001 г. критические  концентрации были предложены для следующих  препаратов 2-го ряда (для критической  пропорции в 1%):

• капреомицин - 40 мкг/мл;
• протионамид - 40 мкг/мл;
• канамицин - 30 мкг/мл;
• виомицин - 30 мкг/мл;
• циклосерин - 40 мкг/мл;
• аминосалициловая кислота - 0,5 мкг/мл;
• офлоксацин - 2 мкг/мл.

Результаты роста  оценивают через 4 нед как предварительный  и через 6 нед культивирования - как  окончательный.

Для определения  лекарственной чувствительности к  пиразинамиду, который широко используют в современной химиотерапии туберкулёза, рекомендуемая критическая концентрация составляет 200 мкг/мл. Однако до сих  пор нет общепринятого метода определения лекарственной устойчивости к этому препарату на твёрдых  питательных средах, поскольку его  антибактериальная активность проявляется  только в кислой среде (pH <6), что  технически трудно выдержать. К тому же многие клинические культуры микобактерий туберкулёза неохотно растут на яичных средах с кислой средой.

Чтобы оценить качество результатов определения лекарственной  чувствительности микобактерий, рекомендовано  каждую новую партию среды Левенштейна-Йенсена  контролировать параллельным определением чувствительности стандартного музейного  штамма H37Rv. Кроме того, существуют определённые микробиологические критерии, которые  необходимо выдерживать, чтобы методики давали хорошо воспроизводимый и  правильно интерпретируемый результат. К таким можно отнести жизнеспособность культуры микобактерий туберкулёза, правила  получения гомогенной взвеси и суспензии, правила отбора культур микобактерий туберкулёза, репрезентативность отобранной бактериальной массы. Достоверность  определения лекарственной устойчивости снижается при чрезвычайно скудном  бактериовыделении.

В последнее время  перспективным признан метод  определения лекарственной чувствительности с помощью автоматизированных систем. Наиболее совершенным в этой области  являются разработки на основе ВАСТЕС MGIT-960. В этом случае лекарственную  чувствительность микобактерий туберкулёза  определяют на основе модифицированного  метода пропорций. В процессе определения  происходит сравнение скорости роста  микобактерий туберкулёза в контрольной  пробирке и в пробирках с лекарственными препаратами. Для определения чувствительности к стрептомицину, изониазиду, рифам-пицину и этамбутолу используют обогащающие  добавки и антибиотики, входящие в набор SIRE kit. Для определения  чувствительности к пиразинамиду используют набор PZA kit. В ходе выполнения теста  суспензией микобактерий туберкулёза  инокулируются тестовые пробирки с  лекарственными препаратами, а также  контрольные пробирки с разведением  суспензии в 100 раз для всех препаратов, за исключением пиразинамида, где  разведение суспензии составляет 10 раз. Критерием устойчивости служит индикатор роста микобактерий величиной  в 100 GU при достижении роста в контрольной  пробирке 400 GU (см. «Культуральные методы выделения микобактерий»). Учёт и  интерпретация результатов ведутся  автоматически и задаются вводимой или выбранной программой.

В качестве критических  концентраций используют финальные  концентрации в тестовой пробирке с  жидкой питательной средой. В настоящее  время разработаны критические  концентрации как к препаратам 1-го ряда, так и к некоторым препаратам 2-го ряда. Необходимо отметить, что  определение чувствительности микобактерий туберкулёза к циклосерину и  аминосалициловой кислоте выполняют  только на яичных питательных средах.

Детально разработанный  протокол работы по описанной системе  позволяет проводить исследование лекарственной чувствительности как  на выделенной культуре (с плотной  питательной средой), так и с  использованием первичного роста микобактерии в MGIT-пробирке. Последний вариант  существенно сокращает время  проведения культуральных исследований, позволяя получить полные результаты о культуре микобактерий туберкулёза (включая сведения о лекарственной  чувствительности) уже через 3 нед  с момента сбора материала, в  то время как традиционным методом  это удаётся получить лишь к 3-му месяцу. Вовремя полученные результаты, когда больной находится в  интенсивной фазе лечения, могут  компенсировать относительную дороговизну  исследований.

Дифференциация  микобактерий

С учётом того, что  используемые питательные среды  не являются строго селективными. последующую  дифференциацию выделенных микобактерий признают обязательной. Необходимость  дифференциации микобактерий обусловлена  рядом особенностей патологических процессов, вызываемых представителями  рода: различным течением и исходом  туберкулёза и микобактериозов, наличием природной лекарственной  резистентности к некоторым противотуберкулёзным препаратам.

Признано, что первичную  идентификацию микобактерий комплекса  М. tuberculosis от нетуберкулёзных микобактерий осуществляют по следующим характеристикам: скорость роста на плотных питательных  средах, пигментообразование, морфология колоний, наличие кислотоустойчивости  и температурный оптимум роста.

К сожалению, не существует какого-либо одного лабораторного метода, позволяющего с достоверностью отличить микобактерии комплекса М. tuberculosis от других кислотоустойчивых микобактерий, тем не менее сочетание вышеописанных  признаков с результатами ряда приводимых ниже биохимических тестов позволяет  провести идентификацию микобактерий комплекса М. tuberculosis с вероятностью до 95%.

Для дифференциации микобактерий комплекса М. tuberculosis (М. tuberculosis, М. bovis, М. bovisBCG, М. africanum, М. microti, М. canettii и других) от медленно растущих нетуберкулёзных микобактерий применяют  основные биохимические тесты, выявляющие наличие следующих признаков:

• способности продуцировать никотиновую кислоту (ниациновый тест):
• нитратредуктазной активности;
• термостабильной каталазы;
• роста на среде с натрием салициловокислым (1 мг/мл).

В качестве дополнительных можно использовать также тесты  роста на среде, содержащей 500 мкг/мл паранитробензойной кислоты или 5% хлорида  натрия.

Многие бактериологические лаборатории идентифицируют эти  микроорганизмы лишь на уровне комплекса, что обусловлено ограниченными  возможностями лабораторий и  методическими возможностями специалистов.

В большинстве же случаев на практике для дифференциации М. tuberculosis и М. bovis бывает достаточно следующих тестов: ниацинового, на наличие  нитратредуктазы, на наличие пиразинамидазы и регистрации роста на среде, содержащей 2 мкг/мл гидразида тиофен-2-карбоксиловой  кислоты. При этом учитывают, что  микобактерии комплекса М. tuberculosis характеризуются  следующей совокупностью признаков:

• медленным ростом (более 3 нед);
• температурой роста в пределах 35-37 ^oС;
• отсутствием пигментообразования (цвет слоновой кости);
• выраженной кислотоустойчивой окраской;
• положительным ниациновым тестом;
• положительным нитратредуктазным тестом;
• отсутствием термостабильной каталазы (68 ^oС).
• отсутствием роста на среде Левенштейна-Йенсена, содержащей:
• 1000 мкг/мл натрия салициловокислого,
• 500 мкг/мл паранитробензойной кислоты,
• 5% хлорида натрия:
• ростом в присутствии 1-5 мкг/мл тиофен-2-карбоксиловой кислоты.

Актуальность дифференциации выделенных микобактерий будет заметно  возрастать с ростом частоты регистрации  случаев ВИЧ/СПИДа, ассоциированных  с туберкулёзом или микобактериозами. В настоящее время нет абсолютной уверенности готовности практических региональных лабораторий корректно  выполнять данный объём работ.

Иммунологическая  диагностика туберкулеза

Существует целый  ряд универсальных феноменов, препаратов и иммунологических тестов, которые  первоначально были обнаружены именно при туберкулёзе или на модели иммунного ответа на микобактерии. К ним относят БЦЖ и туберкулин, такой феномен, как кожная ГЗТ (туберкулиновые пробы - реакции Пирке и Манту), реакцию на подкожное введение туберкулина  сенсибилизированным животным (феномен  Коха). Одни из первых антитела при инфекционном заболевании были также обнаружены при туберкулёзе. Разумеется, чем  глубже понимание механизмов противотуберкулёзного  иммунитета и их генетического контроля, тем шире может быть использование  иммунологических методов и препаратов, воздействующих на иммунитет, для решения  практических проблем фтизиатрии.

Самой важной и сложной  практической проблемой в настоящее  время считают выявление туберкулёза  в процессе массового скрининга  населения. Однако, несмотря на многочисленные сообщения об «успехах» (на ограниченном материале), нет подходящего для  этих целей иммунологического метода (воспроизводимого в «любых руках») и препарата.

Иммунологические  методы, в частности серологические исследования (определение антигенов, антител) и туберкулинопровокационные  пробы, весьма широко используются в  клинической практике.

На первом месте  среди иммунологических исследований, применяемых при дифференциальной диагностике, находятся серологические методы - определение антигенов и  антител в разных средах организма.

Специфичность определения  антител к микобактериям туберкулёза  зависит от используемых при иммунном анализе антигенов. Предложено значительное количество антигенов, самый первый из которых - туберкулин ППД:

• ППД и другие комплексные препараты из культуральной жидкости;
• ультразвуковой дезинтеграт;
• тритоновый экстракт и другие комплексные препараты клеточных стенок;
• 5-антиген (Daniel);
• 60-антиген (Coccito);
• липоарабиноманнан;
• корд-фактор (трегалоза-6,6-ди-миколат);
• фенольный и другие гликолипиды;
• липополисахариды;
• фибронектинсвязывающий антиген;
• белки (чаще всего рекомбинантные); 81,65,38,34,30,19,18,16,15.12 КДА и др.

В результате многолетних  исследований российских и зарубежных учёных были выявлены основные закономерности антителообразования и эффективности  серологической диагностики туберкулёза: чем более комплексный антиген, тем выше чувствительность и ниже специфичность тестов. Специфичность  в разных странах различается  в зависимости от инфицированности населения М. tuberculosis и нетуберкулёзными микобактериями, от проведения вакцинации БЦЖ и др. У детей информативность  серодиагностики ниже, чем у взрослых. При первичном туберкулёзе (чаще дети) более информативно определение IgM. при вторичном - IgG. У ВИЧ-ннфицированных информативность серодиагностики  при определении антител снижается. Эффективность определения антител  зависит от ряда «клинических моментов»: активности процесса (наличия или  отсутствия «выделения» микобактерий, наличия полостей распада, степени  инфильтрации), распространённости процесса, длительности его течения.

Чувствительность  метода иммуноферментного анализа (ИФА) составляет около 70%. Недостаточная  эффективность исследования связана  с его низкой специфичностью. Ранее  рассматривали возможности применения серологического скрининга в группах высокого риска, в частности среди лиц с посттуберкулёзными изменениями в лёгких.

Для повышения специфичности  ИФА продолжают поиски более специфичных  антигенов, в том числе получаемых генно-инженерным путём: ESAT-6 и др. (см. выше). Применение строго специфичных  антигенов (38 кДа, ESAT) повышает специфичность. но значительно уменьшает чувствительность анализа. Наряду с ИФА (экспериментальные  лабораторные тест-системы. например Pathozyme ELISA kit) предложены также наборы иммунохроматографические с латеральной фильтрацией (Mycodot), а также другие подобные тесты (дот-анализ на мембране) с визуальной оценкой  результата исследования. При проведении этих тестов анализ проходит в течение 10-30 мин; они не требуют специального оборудования, требуют визуальной оценки результатов, что связано с известной  субъективностью. Указанные методы имеют примерно те же характеристики чувствительности и специфичности (70% и 90-93% соответственно), что и традиционный ИФА.

Применение методов  иммунного анализа имеет определённое значение в качестве дополнительного, учитываемого в комплексе используемых методов, при дифференциальной диагностике  туберкулёза, особенно при диагностике  его внелёгочных форм. Наибольшую эффективность метод ИФА имеет  в диагностике туберкулёзного менингита  при исследовании спинномозговой жидкости. В этом случае чувствительность анализа  составляет 80-85%, а специфичность 97-98%. Имеются сведения об эффективности  определения антител к микобактериям  туберкулёза в слёзной жидкости при диагностике туберкулёзного увеита.