Диагностика микоплазма – инфекции культуральным методом

Рисунок 1.3 – Морфология  M. Hominis а) - морфологические превращения при оптимальных условиях культивирования in vitro;  б) - морфологические формы при неоптимальных условиях, на стационарной фазе роста культуры

Микоплазмы не образуют так называемых покоящихся форм или  спор. Подобно другим неспорообразующим бактериям микоплазмы в неблагоприятных условиях переходят в некультивируемое состояние, а также образуют “минимальные тела”, не способные к размножению, так как они, вероятно, не содержат ДНК [7].

Клетки большинства бактерий могут быть покрыты оболочкой  – полимерной субстанцией, которая имеет множество свойств и функций. Эта оболочка, или капсула, отлична от двухслойной мембраны и располагается над ней. У бактерий термин “капсула” используется для определения высокомолекулярных полимеров, которые “прикрепляются” к поверхности бактерий. Хотя пептидогликановая клеточная стенка, которая характерна для большинства прокариот, и отсутствует у представителей класса Mollicutes,  однако для некоторых видов микоплазм описаны капсулы или капсулоподобные структуры.  Ими обладают Mycoplasma mycoides, M. gallisepticum, M. hyopneumoniae, M. meleagridis, M. dispar,  M. pneumoniae,  M. pulmonis, M. synoviae, M. hominis. Среди уреаплазм капсулы способны образовывать лишь некоторые штаммы Ureaplasma urealitycum.

1.3 Чувствительность микоплазм к физическим и химическим факторам

Микоплазмы высокоустойчивы  к действию низких температур. При  температуре от -20°С до -65°С большинство бульонных культур сохраняют жизнеспособность в течение 12 месяцев, при температуре +4°С – около 1.5 месяцев. Применение 50% глицерина на питательной среде резко увеличивает сроки сохранения жизнеспособности [4].

Устойчивость микоплазм  к более высоким температурам зависит от состава среды, в которой они находятся. В средах с повышенным содержанием белка их устойчивость повышается. В выделениях половых органов при комнатной температуре они выживают в течение 3 – 5 суток [4].

Микоплазмы чувствительны  к изменению рН среды в щелочную сторону. Особенно это касается U. urealyticum, рН свыше 7.5 резко угнетает ее жизнедеятельность [4].

Особо чувствительны микоплазмы к действию ультразвука. Обработка  культуры при частоте 9 кГц и температуре 4°С в течение 30 минут приводит к 100% инактивации. Более продолжительная обработка приводит не только к гибели микоплазм, но и вызывает фрагментацию мембран [4].

M. hominis, в отличие от других бактерий устойчива к ацетату таллия и хорошо развивается при 0.8% его концентрации. Эта способность позволяет эффективно бороться с контаминантами питательных сред.

К сожалению, U. urealyticum этой способностью не обладает. Соли других тяжелых металлов, а также марганца, цинка, кобальта и железа угнетают жизнедеятельность микоплазм.

Ультрафиолетовое облучение, детергенты и обычные дезинфектаторы в обычных концентрациях уверенно уничтожают микоплазмы [4].

1.4 Биохимические свойства урогенитальных  микоплазм

Микоплазмы способны самостоятельно питаться и размножаться. Их клетки окружены трехслойной цитоплазматической мембраной. В цитоплазме клеток имеются нуклеотид, диффузно распределенный в виде нитей ДНК, рибосомы и иногда внутрицитоплазматические мембранные структуры. От прочих бактерий геном микоплазм отличают меньшие размеры (около 4.4-4.8×10⁸Д), но он имеет практически идентичное строение и организацию; хромосома всех Mollicut, как и других бактерий, представляет собой двунитевую кольцевую ДНК; содержание Г+Ц в ДНК составляет 23-40% [2,8]. Цитоплазма микоплазм содержит протеины, липиды, углеводы, РНК и ДНК.

Мембрана составляет 15% всей клетки. Мембраны разных микоплазм, подобно биологическим мембранам других организмов, построены главным образом из белков и липидов. Состав микоплазменных мембран в значительной мере зависит от состава питательной среды,  на которой они растут, и, таким образом, не является постоянным для конкретного вида этих микроорганизмов. Однако в среднем белки составляют около 60% от массы микоплазменной мембраны, остальное приходится на липиды и углеводы.

Мембрана микоплазм полифункциональна, она выполняет не только защитную и транспортную, но и многие другие функции. Именно с мембраной микоплазм связывают патогенные реакции этих микроорганизмов [2,7,8]. На мембране локализованы рецепторные белки и поверхностные антигены.

Отсутствие клеточной  стенки и небольшой объем генетической информации обуславливают требовательность микоплазм к веществам, необходимым для питания и размножения. Они нуждаются в сыворотке крови млекопитающих, содержащей фактор роста (липопротеин).

Микоплазмы не способны к образованию холестерина, основного  компонента собственной мембраны, и потребности в нем восполняют утилизацией его из тканей или питательной среды с его внесением. Холестерин стабилизирует мембрану клетки, придает ей эластичность и обуславливает проникновение и утилизацию жирных кислот. Стерины детоксифицируют жирные кислоты, которые способны вызвать гибель клетки, и служат субстратом для получения энергии.

Кроме этого, патогенные микоплазмы нуждаются в низкомолекулярных  белках и аминокислотах с преобладанием  аргинина, лейцина, глицина, лизина.

Избирательный гидролиз аргинина, мочевины, а также ферментация  глюкозы позволяет производить индикацию урогенитальных микоплазм, а также их дифференцировать.

M. hominis разлагает аргинин, U. urealyticum – мочевину, а M. genitalium – глюкозу [2,9].

1.5 Культуральные свойства микоплазм

Микоплазмы прихотливы к условиям культивирования; в питательные  среды необходимо вносить нативную сыворотку, холестирин, нуклеиновые кислоты, витамины и различные соли. Подходящие основы для них – триптический перевар сердца крупного рогатого скота (например, среды, разработанные В.Д. Тимаковым и Г.Я. Каган), перевар Хотингера, пептон Мартена и др.; также широко применяют среду Эдварда. При их отсутствии для первичного выделения также пригодны куриные эмбрионы; гибель последних наблюдают с 3-5 поссажа. Микоплазмы чувствительны к микроэлементному составу среды – высокое содержание Zn⁺², Mg⁺², Co⁺² и Fe⁺² может ингибировать рост.

На твердых средах образуют характерные мелкие колонии (0.2-1.5 мм) с более темным и зернистым  центром типа “яичницы глазуньи”, напоминающие мелкие колонии L-форм бактерий (Рисунок 1.4). На средах, содержащих кровь, некоторые виды дают a- и b-гемолиз, преимущественно обусловленные образованием перекисей. Обычно колонии появляются на 5-7 сутки (адаптированные штаммы растут быстрее).

Рисунок 1.4 –  Колонии микоплазм на плотной среде

 

На полужидких средах растут по уколу, формируя дисперсные, крошковатые колонии.

На жидких средах дают очень  незначительное помутнение или опалесценцию; некоторые штаммы способны образовывать тончайшую жидкую пленку. Чаще более обильный рост отмечают около поверхности или стенок сосуда, но некоторые виды дают и придонный рост [10].

1.6 Антигенная структура микоплазм

Для микоплазм характерна высокая антигенная гетерогенность разных видов при наличии некоторых межвидовых серологических связей, а также значительный внутривидовой полиморфизм с высокой частотой спонтанных и индуцированных мутаций [2]. Антигенная структура микоплазм имеет видовые различия; основные антигены представлены липидами (фосфо- и гликолипидами), полисахаридами и белками в составе сложных гликолипидных, липогликановых и гликопротеиновых комплексов. Антигенная структура может изменяться после многократных пассажей на бесклеточных питательных средах [7,9,10,11].

1.7  Факторы патогенности микоплазм

У микоплазм факторы  патогенности разнообразны и могут  значительно варьировать. Основные факторы – адгезины, экзо- и эндотоксины, гемолизины, различные ферменты и продукты метаболизма [2,7,9].

• Адгезины. Входят в состав поверхностных антигенов и обуславливают взаимодействие с клетками хозяина. Взаимодействие происходит по типу лиганд-рецепторных взаимодействий и имеет ведущее значение в развитии начальной фазы инфекционного процесса. Они способны находиться в инвагинатах клеточных мембран, что делает микоплазмы недоступными для действия антител, комплемента и прочих факторов защиты.
• Экзотоксины. В настоящее время подобные продукты идентифицированы лишь у нескольких непатогенных для человека микоплазм, в частности у M. neurolyticum и M. gallisepticum. Тем не менее можно предполагать наличие нейротоксина у некоторых штаммов M. pneumoniae, т.к. часто инфекции дыхательных путей сопровождают поражения нервной системы.
• Эндотоксины. Они выделяются у многих патогенных штаммов микоплазм. Их введение лабораторным животным вызывает пирогенный эффект, лейкопению, тромбогеморрагические поражения, коллапс и отек легких.
• Гемолизины. У некоторых видов микоплазм присутствуют гемолизины (наибольшей гемолитической активностью обладает       M. pneumoniae). Большая часть видов вызывает выраженный b-гемолиз, обусловленный синтезом супероксидантов (O₂, H₂O₂ и др.). Предположительно микоплазмы не только сами синтезируют окислительные продукты, но и индуцируют их образование в клетках, что ведет к окислению мембранных липидов.
• Ферменты: Многие микоплазмы синтезируют нейраминидазу, через которую осуществляется взаимодействие с поверхностными клеточными структурами, содержащими сиаловые кислоты. Кроме того, активность фермента нарушает строение клеточных мембран и межклеточные взаимодействия. В числе опасных факторов патогенности – фосфолипаза А и аминопептидазы, гидролизующие фосфолипиды клеточной стенки.

Протеазы вызывают дегрануляцию клеток (в том числе и тучных), расщепление молекул антител и незаменимых аминокислот (в частности, аргинина), РНКазы, ДНКазы и тимидинкиназы, нарушающие метаболизм нуклеиновых кислот в клетках организма. До 20% общей ДНКазной активности состедоточено в мембранах микоплазм, что облегчает вмешательство фермента в метаболизм клетки. Некоторые микоплазмы (например, M. hominis) синтезируют эндопептидазы, расщепляющие молекулы IgA на интактные мономерные комплексы [9].

1.8 Патогенез микоплазменной инфекции

Микоплазмы как человека, так и млекопитающих, являются “мембранными паразитами”, поскольку основное место их локализации вне или внутри клетки связано с мембранами, в том числе и ядерными [8]. Все микоплазмы вызывают большие изменения в метаболизме клеток организма хозяина: нарушают обмен аминокислот, синтез белков, препятствуют включению предшественников нуклеиновых кислот в ДНК и РНК, нарушая синтез нуклеиновых кислот, а так же привносят новую генетическую информацию [9]. Могут быть причиной спонтанных абортов, преждевременных родов, мертворождений, патологии беременности и родов [2,5].

Патогенез включает формирование местных воспалительных и генерализированных аутоиммунных реакций. Микоплазмы проникают в организм человека ингаляционным или контактным путем, мигрируют через слизистые оболочки и прикрепляются к эпителию сначала посредством неспецифического (в результате броуновского движения), а затем лиганд-рецепторного взаимодействия (через сиалогликопротеиновые рецепторы, посредством связывания поверхностных белков с различными рецепторами, через взаимодействие мембранных липидных структур контактирующих клеток и т.д.) (Рисунок 1.5) [5].

Структурное сходство мембран  микоплазм и мембран клеток организма  человека, их тесное соседство способствует обмену антигенами, вследствие чего происходит маскировка антигенов микоплазм, и ускользанию от иммунологического надзора. Этот же механизм обуславливает возможность развития аутоиммунных реакций в организме человека [9].

 

 

Рисунок 1.5 –  Схема, иллюстрирующая представление о микоплазмах как

поливалентных лигандах (по: Stanbridge, 1982 ). 1 - интактный лимфоцит со

специфическими рецепторами (Р) и другими мембранными антигенами (МА);

2 - микоплазмы (М), присоединяющиеся  к нескольким рецепторам; 3 - "пэтчинг"; 4 - "кэппинг"; 5 - экзоцитоз.

 

Микоплазмы чувствительны  к компонентам комплемента, активированным как по классическому, так и по альтернативному пути, их дефицит и дефекты создают условия для персистенции возбудитиля.

 

2 Материалы и методы исследования

2.1 Материалы

Определение возбудителя  проводили культуральным методом, так как именно он на сегодняшний день является «золотым стандартом» в диагностике урогенитальных микоплазмозов. В работе были использованы стандартные тест-системы “Mycoplasma IST 2” (BioMerieux, Франция). Эта тест-система предназначена для диагностики уреаплазмоза и микоплазмоза, и позволяет получить культуру жизнеспособных уреаплазм и микоплазм наиболее точным из всех существующих методом - посевом со слизистых оболочек половых органов человека.

Выделение живого возбудителя дает возможность определить:

• вид возбудителя ( Ureaplasma urealiticum, Mycoplasma hominis);

• количество возбудителя (КОЕ, то есть индикатор болезнетворности);

• чувствительность возбудителя  к антибиотикам, что позволяет  врачу назначить для лечения  наиболее эффективные препараты  именно для данного пациента, а  не исходить из общих принципов антибиотикотерапии уреаплазмоза и/или микоплазмоза [25].

Определялась чувствительность к следующим антибиотикам:

1. Тетрациклины:

• Тетрациклин – нарушает образование комплекса между транспортной РНК и рибосомой, что приводит к подавлению синтеза белка. Активен в отношении грамположительных, грамотрицательных микроорганизмов, большинства энтеробактерий, активен также в отношении возбудителей венерической и паховой лимфогранулемы. К тетрациклину устойчивы микроорганизмы: Pseudomonas aeruginosa, Proteus spp., Serratia spp., большинство штаммов Bacteroides spp. и грибов, вирусы, бета-гемолитические стрептококки группы А (включая 44 % штаммов Streptococcus pyogenes и 74 % штаммов Streptococcus faecalis) [13].
• Доксициклин – полусинтетический антибиотик группы тетрациклинов широкого спектра действия.

В основе механизма антибактериального действия доксициклина, как и других тетрациклинов, лежит подавление им биосинтеза белка микробной клетки на уровне рибосом. Проникая внутрь клетки, он действует на внутриклеточно расположенных возбудителей. Подавляет синтез протеинов в микробной клетке, нарушает связь транспортных аминоацил-РНК с 30S субъединицей рибосомальной мембраны. Активен в отношении аэробных грамположительных бактерий; анаэробных бактерий; также доксициклин активен в отношении аэробных грамотрицательных бактерий, и в отношении Rickettsia spp., Treponema spp., Mycoplasma spp. и Chlamydia spp. К доксициклину устойчивы Pseudomonas aeruginosa, Proteus spp., Serratia spp., большинство штаммов Bacteroides fragilis [13].

2. Макролиды:

• Джозамицин – антибиотик из группы макролидов, действует бактерицидно. Связывается с 50S-субъединицей рибосомальной мембраны и препятствует фиксации транспортной РНК, блокируя транслокацию пептидов из А-центра, подавляет синтез белка.