Достижения современной молекулярной медицины. Основные положения и понятия геномики, протеомики и биоинформатики

По новой технологии скрининга (в отличие от вышеуказанной) используют информацию о полностью секвенированном  геноме патогена и наличии в нем "существенных" генов. В лабораториях, работающих в области создания новых  антимикробных лекарств, предварительно выбирается ген, который будет использован  для их испытания как таргет (точнее, в качестве мишени будет использован  продукт этого гена).

Таргетный скрининг позволяет в  соответствии с выбором гена отбирать биологически активные вещества с запланированным  механизмом действия (в отличие от традиционного метода, когда поиск  ведется "от клетки к гену"). Первый этап таргетного скрининга начинается с выделения этого гена (соответствующего фрагмента ДНК) из генома. Далее, используя  полимеразную цепную реакцию (ПЦР), фрагмент ДНК амплифицируется (создается  вирусный вектор, который вводится в плазмиду). Количество копий гена умножается. Затем конструируются:

• бесклеточная система, где наработанная матрица служит для получения  информационной РНК, специфичной для  гена;

• бесклеточная рибосомная система, где эта информационная РНК служит для наработки белкового продукта, кодируемого данным геном.

Бесклеточная система, используемая для первичного отбора и оценки активности потенциальных лекарственных веществ  — ингибиторов фермента (продукта изучаемого гена), содержит как фермент, так и его субстрат. Когда наработан  белок (продукт избранного для изучения гена), тогда возникает вопрос: как  узнать функцию этого белка? Например, какую реакцию он катализирует как  фермент, чтобы по подавлении этой реакции  отобрать ингибиторы. При близком  сходстве этого белка с белком из "модельного" организма подобрать  бесклеточную систему (субстрат для  нового белка) нетрудно. Если сходство есть, но не очень близкое, то прибегают  к анализу "мотивов" — коротких участков аминокислотной последовательности, которые распределены по всей длине  белковой цепи и могут оказаться  сходными у двух белков.

Когда такого сходства нет или сходство обнаружено, но нет ясности в функции  самого гомолога, т.е. белка, взятого  для сравнения, прибегают еще  к одному способу: устанавливают, с  какими белками он контранскрибируется (переписывается в последовательность матричной информационной РНК). Если транскрипт — часть полицистронной (эквивалентной гену) информационной РНК, необходимой для протекания в последующем определенного  метаболического процесса с участием нескольких ферментов, тогда поиск  функции изучаемого белка, включенного  в группу этих ферментов, сужается.

В целом подходы к установлению функций продуктов изучаемых  генов многочисленны, и их разнообразие неуклонно растет. Таким образом, можно, в конечном счете, проводить  серийные испытания потенциальных  ингибиторов функций почти любого из тысяч генов, составляющих геном  патогена и обнаруживать все возможные "уязвимые точки" микробной клетки. Подобный путь достижения цели породил  в литературе термин "обратная генетика", означающий ведение исследования не от клетки и ее фенотипа к гену, а, наоборот, от гена к клетке и к  ее фенотипу.

Полное секвенирование генома в  сочетании с применением методов  генетической инженерии вносит свой вклад в фармацию еще в одном  отношении. У патогенных микроорганизмов  открыты гены, "существенные" для  протекания инфекционного процесса, но "несущественные" при росте in vitro — на искусственных питательных  средах. В последнем случае они  ускользают от внимания исследователя, не поддаются идентификации и  не могут быть использованы как таргеты  при поиске лекарств. Скрытые или  по образному выражению "молчащие" in vitro гены патогенных микроорганизмов  получили название ivi генов (генов вирулентности), несмотря на то, что в их число  входят не только гены, кодирующие образование  токсинов, адгезинов и других факторов вирулентности. К ним относят  также гены ферментов и транспортных белков, позволяющих патогенной микробной  клетке жить и размножаться в тканях макроорганизма в условиях дефицита некоторых органических веществ  и неорганических ионов.

4. Проект "Геном человека"

Полное секвенирование генома человека (несколько миллиардов пар нуклеотидов  и идентификация генов всех сорока восьми хромосом) — задача качественно  более трудная, чем секвенирование генома прокариот и низших эукариот. В начале 1990-х гг. был обнародован  Международный проект "Геном человека", целью которого было решение указанной  выше кардинальной проблемы с привлечением сил и средств ряда стран, в  том числе и России. В 2003 г. этот проект был успешно завершен. Ученые описали все 25 000 генов, присутствующих в хромосомах каждой клетки. За это  время были созданы базы ДНК из образцов генов десятков тысяч людей.

В ДНК генома человека обнаружены многочисленные некодирующие последовательности. Вначале к ним прилагалось  условное определение "мусор", под  которым подразумевались "отходы—излишки, накапливающиеся по мере эволюции генома". Однако в настоящее время обнаружено, что некодирующие последовательности в геноме человека не случайны. Любопытные факты установлены в последние  годы при сопоставлении генома человека и человекообразных обезьян. Ожидалось, что эти различия по сравнению  с парадигмой дарвинизма о том, что "человек произошел от обезьяны", окажутся довольно значительными и  что наш общий предок весьма отдален  от нас, а дивергенция произошла  очень давно.

Однако это сходство оказалось  весьма близким, увеличивая количество загадок. К их числу относится  постоянное присутствие в геноме человека последовательностей вирусного  происхождения (своего рода "насыщенность" генома современного человека молекулами вирусных ДНК).

Также было обнаружено отличие между  геномами представителей разных наций. Это очень деликатный вопрос, учитывая еще совсем недавние трагические  страницы истории человечества. Тем  не менее закрывать глаза на объективные  факты из-за несовершенства человеческого  общества было бы неразумно, тем более  что познание собственного генома дает человечеству в новом тысячелетии  предпосылки для своего совершенствования, над которыми не довлеют ни религиозные  догмы, ни разрушительная революционная  демагогия.

5. Генотерапия

Сравнивая гены, ученые смогут выявить  связи разных генетических вариаций и мутаций со всевозможными заболеваниями.

Прогресс в познании человека привел к возникновению такого важного  практического приложения геномики к медицине, как генотерапия. С  ее помощью можно лечить многие наследственные заболевания, которые дифференцируются на моно- и полигенные.

Моногенные заболевания на молекулярном уровне сводятся к дефекту какого-либо одного белка в клетке — фермента транспортного или структурного белка. Во-первых, белка может не хватать, а, во-вторых, его функции  могут быть нарушены. Так, мутация, в  результате которой изменяется активность того или иного фермента, может  приводить или к накоплению токсичного субстрата, или к дефициту соединения, необходимого для нормального функционирования клетки; мутация в гене, кодирующем структурный белок, — к серьезным  нарушениям клеток, тканей или органов.

Кроме того, мутация в гене, экспрессирующемся  в одной ткани, может сказаться  самым серьезным образом на другой ткани и привести к появлению  множества симптомов. Например, мутация  в гене печеночного фермента фенилаланиндегидроксилазы, в результате которой блокируется  превращение фенилаланина в тирозин, приводит к повышению уровня эндогенного  фенилаланина в крови, неправильному  формированию миелиновой оболочки вокруг аксонов нервных клеток ЦНС и, как следствие, — к тяжелой  умственной отсталости.

Полигенность заболевания означает, что несколько белков в клетке обладают теми или иными дефектами. В каждой ткани организма экспрессируется  свой набор из всей совокупности генов, но есть мутации, которые приводят к  болезням, затрагивающим буквально  все органы и ткани: мышцы, глаза, печень, кости, сердце и т.д. Отметим, что такие болезни, как рак  и гипертония считаются полигенными. Некоторые ненаследственные и инфекционные болезни, в частности вирусной этиологии, также причисляются к полигенным.

Вполне естественно, что проведение генотерапии при моногенных заболеваниях показывает лучшие результаты. При  этом ген, с которым ведется работа, должен быть не только картирован, но и  идентифицирован (должна быть известна его функция). К настоящему времени  картировано около одной тысячи генов, включенных в процесс возникновения  и развития моногенных наследственных заболеваний, из которых идентифицировано всего несколько сотен.

При генотерапии требуются предварительное  создание рекомбинантной генетической конструкции с нормальной "здоровой" копией дефектного гена, а также  создание для этой конструкции вектора, переносящего ее в клетки организма. Для нормального функционирования гена необходимы специфические для  каждого гена цис- и трансрегуляторные  последовательности. Первые (цис) локализованы в той же хромосоме и могут  быть непосредственно сцеплены с  геном или находиться на некотором  расстоянии от регулируемого ими  гена, выступая в качестве промотора; нюрые (транс) располагаются в других хромосомах.

Методы введения генов в клетки-мишени при генотерапии весьма разнообразны, но в большинстве случаев недостаточно эффективны. Это связано с встраиванием чужеродной ДНК в геном только небольшого процента клеток ткани, а  также с разрушением ее нуклеазами и т.д. Обнадеживающие результаты получены при использовании генов, "упакованных" в липосомы.

В настоящее время наиболее перспективным  путем переноса генов при генотерапии  является включение их в векторы, построенные на основе ретро- или  аденовирусов. Конечно, здесь прежде всего возникает вопрос о безопасности подобных векторов. Вирусы генетически  модифицируются так, чтобы при сохранении способности проникать в клетку они теряли бы способность к автономной репликации.

Для направленной доставки сконструированной  последовательности учитывается различный  тропизм разных вирусов к определенным видам тканей. Так, представители  аденовирусов высокотропны в отношении  клеток эпителия дыхательных путей, вирус герпеса высокотропен в  отношении нейронов ЦНС и т.д. В перспективе планируется проводить  генотерапию с помощью целых  рекомбинантных хромосом, что позволяет  оперировать рядом генов и  их регуляторных последовательностей  одновременно.

Современная генотерапия направлена только на соматические, а не на половые (зародышевые) клетки.

Генотерапия ех vivo (вне организма) означает, что нормальная копия гена вводится в соматические клетки, предварительно извлеченные из организма пациента. Исправленные клетки наращиваются и  вводятся пациенту трансфузией или  трансплантацией. При этом рекомендуется  использовать клетки именно от этого  больного и их "исправленное" потомство  возвращать ему же, что снимает  проблему отторжения клеток за счет врожденного  иммунитета. Тем не менее использование  только аутологичных клеток сужает возможность  генотерапии, поэтому разработаны  разные методы защиты от иммунного  ответа и неаутологачных клеток, которые  включают, в частности, применение иммуносупрессоров.

При генотерапии in vivo доставка нормального  гена осуществляется непосредственно  в ткани человека (в клетки определенных тканей). При этом промотор гена должен быть трансспецифичен.

Перечень наследственных болезней, связанных с недостаточностью того или иного фермента, возрастает по мере раскрытия их биохимического механизма. Соответственно и подходы к реализации теоретических возможностей генотерапии  привлекают все большее внимание и конкретизируются. В качестве примера  можно привести использование генотерапии  в лечении муковисцидо-за. Ген  муковисцидоза — муковисцидозный  трансмембранный регулятор (МТР) кодирует мембранный белок — муковисцидозный  трансмембранный регулятор проводимости (МТРП). Основная функция МТРП — создание регулируемого циклическим 3,5-аденозинмонофосфатом (цАМФ) хлорного канала. Мутации в  гене ведут к изменению количества или структуры данного белка, что нарушает транспорт ионов  хлора и воды через мембраны клеток эпителия ряда органов. Выделяемая при  этом экзокриновыми железами слизь  обезвоживается, и вязкость ее повышается. Это приводит к воспалению и размножению  инфекционных агентов (вторичная патология). При муковисцидозе наиболее сильно поражаются легкие (бронхи).

Предпосылками для применения генотерапии  при муковисцидозе послужили  положительные результаты, полученные на клеточных культурах. Введения только одной копии нормального гена в клетку с дефектным геномом  было уже достаточно для нормализации ионного транспорта. Еще более  обнадеживало, что достаточно было "исправить" 10 % общего числа клеток в монослое, чтобы добиться нормализации транспорта хлора во всем монослое (вероятно, за счет обмена ионами между  соседними клетками). Оказалось, что  особенно строгая регуляция функций  нормального чужеродного гена, кодирующего  белок МТРП, не нужна: этот белок (при  его избыточном синтезе) не токсичен.

После подробных доклинических  исследований генотерапия муковисцидоза  была апробирована в клинике. Нормальный ген в составе модифицированных аденовирусов доставлялся в клетки эпителия легких с помощью липосом. Однако результаты генотерапии в  клинике оказались не столь блестящими: из нескольких сотен случаев только отдельные опыты оказались удачными. Тем не менее сам по себе переход  от экспериментов в области генотерапии  муковисцидоза к клинике является большим успехом.

Наследование генов и признаков

Результаты  взаимодействия генов двух родительских геномов в зиготе и развившемся  из нее многоклеточном организме  проявляются в контролируемых ими  признаках, которые в той или  иной мере передаются из поколения  в поколение. Такое наследование зависит от многих причин.

В классической генетике длительное время считалось, что вклад обоих родителей  в геном потомства примерно одинаковый как по материнской, так и по отцовской  линии семейных родословных. На этой основе сформулировали одно из первых правил наследования - равнозначность и взаимосвязанность функций  двух разных по происхождению аллелей  одних и тех же генов (или эквивалентность реципрокных скрещиваний). Выделили два варианта и ряд типов наследования с учетом количества генов, их происхождения (материнское или отцовское), локализации в аллельных или неаллельных локусах аутосом и половых хромосом, характера проявления (доминантность или рецессивность), а также особенностей (механизмов) взаимодействия между генами.

Однако  уже во второй половине XX в. установили: во многих случаях вклад одного из родителей значительно отличается от вклада другого родителя. Было показано: функции родительских генов на протяжении всего онтогенеза могут изменяться вплоть до дифференциального отключения материнских либо отцовских аллелей. В основе этого явления лежит  эпигеномный процесс или маркирование локусов хромосом одного из родителей, приводящее к выключению экспрессии расположенных в них аллелей. Данное явление получило название импринтинга. Термин впервые применен во втором десятилетии XX в. австрийским зоологом Конрадом Лоренцом. Наблюдая за поведением утят, только что вылупившихся из яичной скорлупы, он обратил внимание: они ищут взглядом свою маму-утку. Если в поле их зрения попадает хозяин или хозяйка утки либо пробегающая мимо собака или кошка - за ними, как за своей матерью, утята следуют всю дальнейшую жизнь.