Клонирование человека: этические проблемы

Таким образом, во многих работах показано, что в случае амфибий донорами ядер могут быть лишь зародыши на ранних стадиях развития, хотя и клоны  дифференцированных клеток удавалось  «доводить» до поздних стадий, особенно при использовании метода серийных пересадок.

Опыты с амфибиями показали, что  ядра различных типов клеток одного и того же организма генетически  идентичны и в процессе клеточной  дифференцировки постепенно теряют способность обеспечивать развитие реконструированных яйцеклеток, однако серийные пересадки ядер и культивирование  клеток in vitro в какой-то степени увеличивает эту способность.

У млекопитающих в качестве доноров  используются малодифференцированные стволовые клетки или клетки ранних эмбрионов. Работа методически оказалась  довольно трудной, прежде всего потому, что объем яйцеклетки у млекопитающих  примерно в тысячу раз меньше, чем  у амфибий. Однако эти трудности  были успешно преодолены. Экспериментаторы научились микрохирургически удалять  пронуклеусы из зигот (оплодотворенных  яйцеклеток) млекопитающих и пересаживать в них клеточные.

Опыты на мышах закончились полной неудачей – клоны гибли на стадии бластоцисты, что связано очевидно, с очень ранней активацией генома зародыша – уже на стадии 2-х клеток. У других млекопитающих, в частности, у кроликов, овец и крупного рогатого скота, активация первой группы генов  в эмбриогенезе происходит позднее, на 8-16-клеточной стадии. Возможно поэтому  первые значительные успехи в клонировании эмбрионов были достигнуты на других видах млекопитающих, а не на мышах.

Для кроликов (Стик и Робл, 1989) был  получен результат – 3,7% реконструированных яйцеклеток развились до нормальных животных.

Работа с реконструированными  яйцеклетками крупных домашних животных, коров или овец, идет несколько  по-другому. Их сначала культивируют не in vitro, a in vivo – в перевязанном яйцеводе овцы – промежуточного (первого) реципиента. Затем их оттуда вымывают и трансплантируют в матку окончательного (второго) реципиента – коровы или овцы соответственно, где их развитие происходит до рождения детеныша. По данным одних авторов реконструированные зародыши лучше развиваются в яйцеклетке, чем в культуральной среде, хотя некоторые исследователи получили неплохие результаты и при культивировании.

Таким образом, была в целом решена проблема клонирования крупного рогатого скота. Например, в одном из экспериментов, 92 яйцеклетки из 463 развились до взрослых коров.

Позднее были получены клоны овец. В 1993-1995 годах, группа исследователей под  руководством Уилмута получила клон овец – 5 идентичных животных, донорами ядер которых была культура эмбриональных  клеток. Клеточную культуру получали следующим образом: выделяли микрохирургически  эмбриональный диск из 9-дневного овечьего эмбриона (бластоцисты) и культивировали клетки in vitro в течение многих пассажей (по крайней мере до 25). Сначала клеточная  культура напоминала культуру стволовых  недифференцированных эмбриональных  клеток, но вскоре, после 2-3-х пассажей, клетки становились уплотненными и  морфологически сходными с эпителиальными. Эта линия клеток из 9-дневного зародыша овцы была обозначена как TNT4.

Чтобы донорское ядро и реципиентная цитоплазма находились на сходных стадиях  клеточного цикла, останавливали деление  культивируемых клеток TNT4 на определенной стадии (G0) и ядра этих клеток пересаживали в энуклеированные яйцеклетки (соответственно на стадии метафазы II). Реконструированные эмбрионы заключали в агар и трансплантировали  в перевязанные яйцеводы овец. Через 6 дней эмбрионы вымывали из яйцевода первого  реципиента и исследовали под  микроскопом. Отбирали те, которые достигли стадии морулы или бластоцисты и  пересаживали их в матку овцы - окончательного реципиента, где развитие продолжалось до рождения. Родилось 5 ягнят (самок) из них 2 погибли вскоре после рождения, 3-й в возрасте 10 дней, а 2 оставшихся нормально развивались и достигли 8-9-месячного возраста. Фенотипически  все ягнята были сходны с породой  овец, от которой получали исходную линию клеток TNT4. Это подтвердил и генетический анализ.

Эта работа, особенно в части культуры эмбриональных клеток, - значительное достижение в клонировании млекопитающих, хотя она и не вызвала столь  шумного интереса, как статья того же Уилмута с соавторами, опубликованная в начале 1997 года, где сообщалось, что в результате использования  донорского ядра клетки молочной железы овцы было получено клональное животное - овца по кличке Долли. Последняя работа методически во многом повторяет предыдущее исследование, но в ней ученые использовали не только эмбриональные, но еще и фибробластоподобные клетки (фибробласты – клетки соединительной ткани) плода и клетки молочной железы взрослой овцы. Клетки молочной железы получали от шестилетней овцы породы финн дорcет, находящейся на последнем триместре беременности. Все три типа клеточных культур имели одинаковое число хромосом – 54, как обычно у овец. Эмбриональные клетки использовали в качестве доноров ядер на 7-9-м пассажах культивирования, фибробластоподобные клетки плода - на 4-6-м пассажах и клетки молочной железы - на 3-6-м пассажах. Деление клеток всех трех типов останавливали на стадии G0 и ядра клеток пересаживали в энуклеированные ооциты (яйцеклетки) на стадии метафазы II. Большинство реконструированных эмбрионов сначала культивировали в перевязанном яйцеводе овцы, но некоторые и in vitro в химически определенной среде. Коэффициент выхода морул или бластоцист при культивировании in vitro в одной серии опытов был даже вдвое выше, чем при культивировании в яйцеводе (поэтому, видимо, нет строгой необходимости в промежуточном реципиенте и можно обойтись культивированием in vitro. Однако для полной уверенности в этом нужны дополнительные данные).

Выход морул или бластоцист в  серии опытов с культурой клеток молочной железы был примерно втрое  меньше, чем в двух других сериях, когда в качестве доноров ядер использовали культуру фибробластов плода  или эмбриональных клеток. Число  живых ягнят в сравнении с  числом пересаженных в матку окончательного реципиента морул или бластоцист было также в два раза ниже. В  серии опытов с клетками молочной железы из 277 реконструированных яйцеклеток был получен только один живой  ягненок, что говорит об очень  низкой результативности такого рода экспериментов (0,36%). Анализ генетических маркеров всех семи родившихся в трех сериях экспериментов живых детенышей  показал, что клетки молочной железы были донорами ядер для одного, фибробласты  плода - для двух и эмбриональные  клетки - четырех ягнят. Овца по кличке Долли развилась из реконструированной яйцеклетки, донором ядра которой  была культивируемая клетка молочной железы овцы породы финн дорсет и фенотипически  не отличается от овец этой породы, но сильно отличается от овцы-реципиента. Анализ генетических маркеров подтвердил этот результат.

Успех[3][3] авторов этой работы прежде всего связан с использованием длительных клеточных культур, так как после многих пассажей в культуре клеток могли быть отобраны малодифференцированные стволовые клетки, которые, вероятно, и были использованы как доноры ядер. Большое значение также имел тот факт, что авторы, учитывая результаты своих предыдущих работ, синхронизировали стадии клеточного цикла яйцеклеток реципиентов и клеток доноров.

Из других млекопитающих были успешно  клонированы свиньи.

Из изложенного выше следует, что  методически или технически клонирование взрослых млекопитающих разработано  еще недостаточно для практического  применения. Для этого необходимо расширить круг исследований, включив  в него, кроме овец, представителей и других видов животных. Такие  работы необходимы, чтобы установить, не ограничивается ли возможность клонирования взрослых млекопитающих особенностями  или спецификой какого-либо одного или нескольких видов.

Затем необходимо существенно повысить выход жизнеспособных реконструированных эмбрионов и взрослых клонированных  животных, выяснить, не влияют ли методические приемы на продолжительность жизни, функциональные характеристики и плодовитость животных. Для клонов высок риск дефектного развития реконструированной яйцеклетки, главной причиной которого может быть неполное репрограммирование генома донорского ядра.

Что же касается возможности клонирования человека, который вызвал бурную реакцию  общества, то о ней говорить пока не приходиться.

Перспективным направлением в технологии клонирования животных является изучение генетических механизмов развития и  дифференцировки клеток. Так, Рудольф  Яниш из Whitehead Institute обнаружил, что 70-80 генов, которые обычно активизируются в  развивающихся мышиных эмбрионах, у клонов оказываются либо неактивны, либо демонстрируют пониженную активность. Хотя непонятно, что же делают эти  гены, однозначно установлено, что они  включаются одновременно с еще одним  геном, Oct4. Этот ген, в свою очередь, дает эмбрионам возможность создавать  плюрипотентные клетки – то есть клетки, которые могут превратиться в  любую ткань. Возможно, что часть  активизирующихся одновременно с этим генов также задействуется в  этом процессе. Теперь ученым предстоит  выяснить, что заставляет эти гены молчать. В случае удачи наука  сделает важный шаг вперед в разработке методологии клонирования.

Клонирование человека — каковы перспективы?

17 сентября в Австралии была  выдана первая в мире лицензия  на клонирование человеческих  эмбрионов. Её получила фирма  «Sydney IVF», специализирующаяся на  экстракорпоральном оплодотворении. Это событие стало одной из  многочисленных вех в запутанной, местами скандальной и весьма  неоднозначно трактуемой истории  клонирования клеток. Среди достижений  двадцатого века клонирование  животных снискало неутихающий  интерес со стороны ученых, прессы, юристов, религиозных деятелей  и широкой публики. Внимание  к данному методы обусловлено  теми широкими терапевтическими  возможностями, которые он открывает  и, одновременно, теми этическими  проблемами, которые он в себе  таит. Для того, чтобы разобраться  в оценке клонирования, необходимо  рассмотреть вопрос с нескольких  сторон: с биологической, с этической  и с юридической.

С точки зрения биологии, клонирование — это создание генетически идентичной копии биологической особи, клетки или ткани. В приведенном определении следует обратить особое внимание на слово «генетически»: копия не является полностью идентичной хотя бы потому, что на формирование особи огромное влияние оказывают факторы внешней среды. Технически наиболее распространена следующая схема клонирования. Из яйцеклетки удаляют её собственное ядро. Взамен в клетку вставляют ядро, полученное от клонируемой особи. Затем полученную клетку можно подсадить в матку, где она, если всё пойдет гладко, разовьется в полноценный организм, генетически идентичный донору ядра.

По описанной методике в 1996 году была создана знаменитая овечка Долли. В 2001 году американской компании Advanced Cell Technologies удалось вырастить эмбрион  человека методом клонирования. Его  развитие достигло стадии шести клеток. С той поры не утихают споры  о возможности и целесообразности клонирования человека. С этической  точки зрения проблема представляется далеко не простой. В настоящее время  репродуктивное клонирование человека, т.е. клонирование с целью размножения, вызывает однозначно негативную оценку. Законодательно оно запрещено в  пятидесяти странах, в том числе  в России (закон «О временном запрете  на клонирование человека»), а в Декларации ООН о клонировании человека от 2005 года говорится о недопустимости таких методов. Что касается клонирования в исследовательских, а в будущем, возможно, и в терапевтических целях, то с ним ситуации пока остается неопределенной. ООН напрямую не запрещает такие эксперименты, но и не разрешает.

При терапевтическом клонировании развитие эмбриона останавливают на ранней стадии, а полученные клетки используют для научных исследований или для лечения заболеваний. Чем так ценны эти клетки для  науки и для клинической практики? В исследованиях линии клеток с заданным генотипом можно использовать при изучении механизмов развития ряда заболеваний с наследственным механизмом. Например, пересадив ядро из клетки пациента, страдающего болезнью Альцгеймера, в яйцеклетку, можно получить линию клеток для экспериментов, направленных на раскрытие патогенеза и отработку методов лечения заболевания. Естественно, такие работы будут носить не чисто теоретический, но и прикладной характер, что позволит быстрее разрабатывать новые методы терапии.

В практической медицине для клеток, полученных методом клонирования, также  уготовано множество ниш. Живой  интерес к данному типу клеток обусловлен во-первых тем, что они  являются стволовыми и, будучи недифференцированными, потенциально могут превратиться в  любую ткань. Во-вторых, в результате клонирования можно получить  клетки, идентичные по генотипу клеткам пациента. Их трансплантация не приведет к несовместимости и не потребует применения иммуносупрессоров — средств, имеющих массу побочных эффектов.

В настоящее время стволовые  клетки пытаются использовать для лечения  ряда заболеваний, при которых собственные  клетки пациента погибают. Среди них — дегенеративные поражения головного и спинного мозга, постинфарктный кардиосклероз, поражения мышц. К примеру, современная медицина практически бессильна при потере функций спинного мозга вследствие травмы. Есть меры, позволяющие минимизировать количество погибших клеток, есть меры, позволяющие ускорить реабилитацию, но нет способов восстановить разрушенные участки спинного мозга. Возможно, что с помощью стволовых клеток эту задачу со временем удастся решить: подсаженные клетки дифференцируются в нейроны и заместят погибшие участки спинного мозга.

Однако эта привлекательная  перспектива является скорее теоретической: не так просто заставить клетки, способные дифференцироваться в  любую ткань, развиться в нужную ткань в нужном месте. В экспериментах  эмбриональные стволовые клетки при введении в организм начинают неконтролируемо делиться, формируя опухоли-тератомы. Возможно, эту проблему в будущем удастся решить, однако пока отношение к эмбриональным  стволовым клеткам более чем  сдержанное.

Скептицизм по отношению к эмбриональным  стволовым клеткам усиливает  тот факт, что они имеют достойных  конкурентов — стволовые клетки, полученные от взрослых людей (чаще всего из костного мозга). Они успешно используются при лечении онкологических заболеваний крови и имеют преимущества по сравнению с эмбриональными клетками: более безопасны и не вызывают этических разногласий. Недостатком стволовых клеток, полученных от взрослого человека, является их большая дифференцированность — возможно получить не все ткани. И всё же в настоящее время более перспективными кажутся клетки, полученные от взрослого организма, к тому же что их получение не вызывает этических разногласий.

Здесь мы подходим к ещё одному значимому аспекту терапевтического клонирования — этическому. Несмотря на то, что клетки получают из эмбрионов, находящихся на самых ранних стадиях развития, не дальше бластоцисты, возникают споры на тему того, не является ли это скопление клеток человеческим существом, имеющим право на жизнь. Ещё одна проблема заключена в процессе получения яйцеклеток: их можно получить только от женщин, создание in vitro пока не разработано. Перед донорством приходится стимулировать репродуктивную систему женщины большими дозами гормонов, что отрицательно сказывается на её здоровье. По этой причине этичность такого донорства, даже если оно хорошо оплачивается, вызывает сомнения. Многие женщины, особенно из развивающихся стран, пойдут на донорство яйцеклеток во вред своему здоровью — по правильно ли подбивать их на это? Пока для клонирования используются яйцеклетки, оставшиеся ненужными при экстракорпоральном оплодотворении.