Контрольная работа по «Биотехнология»

                      МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И СОЦИАЛЬНОГО

                              РАЗВИТИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

                       БУРЯТСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

                                             Медицинский факультет

 

 

 

 

 

    Контрольная  работа по дисциплине

              «Биотехнология»

                                                                    

                               Вариант №5

 

 

 

 

 

 

                                                                                                                  Выполнила: студ. заочного         

                                                                                               отделения, мед.факультета,

                                                                                               спец.фармации. Беликова ОЮ

                                                                                               Проверил:                                                                                             

                                                               

                         

                                                                       г.Улан-Удэ

                                                                            2013 г.

 

                         

1. Кометаболизм.

Кометаболизм – это особый случай утилизации смешанных субстратов. Кометаболизм впервые наблюдал Фостер в 1962 году у бактерий, утилизирующих углеводороды. Эти бактерии могут расти на метане, как на единственном источнике углерода, то есть они являются метанотрофами. Однако, они не могут утилизировать такие алканы, как этан или пропан, в качестве единственного источника углерода. Когда бактерии росли на смеси метана, этана и пропана, клетки использовали метан, а также этан и пропан, которые окислялись до продуктов, таких как ацетальдегид, уксусная кислота, пропионовая кислота и ацетон соответственно.

Фостер предложил термин соокисление для описания подобного типа трансформации субстратов. Позднее другие исследователи наблюдали подобное явление с другими типами микробной трансформации; они включают не только окисление, но также и гидролиз, дегалогенирование и так далее, то есть термин “кометаболизм” было предложено использовать в более широком смысле.

В 1982 году Дальтон и Стирлинг предложили следующее определение кометаболизма. Кометаболизм – трансформация неростового субстрата в присутствии ростового субстрата или иного метаболизируемого соединения. Под неростовыми субстратами понимают такие, которые не обеспечивают деление клеток. Ростовой субстрат выполняет несколько функций. Во-первых, поставляет энергию для бактериального роста и процессов поддержания метаболизма нерастущих клеток. Во-вторых, поставляет восстановительные эквиваленты, которые позволяют деградировать неростовые субстраты. В-третьих, ростовые субстраты индуцируют синтез катаболических ферментов, которые обнаруживают загрязняющие соединения (поллютанты) и катализируют их трансформацию. Метаболизм неростовых субстратов не поставляет никакой энергии или восстановительных эквивалентов для микроорганизмов.

Структура трансформируемого (соокисляемого) соединения часто не имеет никакой аналогии с ростовым субстратом. В этом случае связь между процессами окисления ростового и трансформируемого (неростового) субстратов реализуется на уровне интермедиатов катаболизма источника углерода. Под этим подразумевают, что при окислении ростового субстрата генерируется энергия, необходимая для функционирования ферментов, осуществляющих окисление неростовых субстратов.

На основе разных механизмов трансформации  неростового субстрата, а также в зависимости от того, является косубстрат ростовым или неростовым, условно можно выделить четыре типа кометаболизма.

Первый тип – трансформация  неростового субстрата до продукта при использовании в качестве косубстрата ростового субстрата.

Второй тип - трансформация неростового субстрата без использования ростового субстрата. Неростовой субстрат используется не как источник углерода, а только как источник энергии, необходимой для осуществления реакций кометаболизма. В обоих рассмотренных случаях трансформация ростового субстрата должна обеспечивать энергией метаболизм другого субстрата, и этот процесс осуществляется только до определенного продукта, который дальше не ассимилируется клетками.

К третьему типу кометаболизма относятся процессы ассимиляции неростовых субстратов, что сопряжено с использованием ростовых субстратов, в результате чего соединения углерода включаются в компоненты клетки. Сначала подобные процессы были описаны как миксотрофия, однако поскольку один из субстратов не является ростовым, этот термин в данном случае является некорректным. Включение углерода неростовых субстратов или продуктов их трансформации в конструктивный метаболизм, который приводит к увеличению биомассы, предложено называть дополнительным метаболизмом. Поскольку данные процессы осуществляются только при ассимиляции ростового субстрата, их можно отнести к кометаболизму. В этом случае продукты трансформации неростовых субстратов являются компонентами клеток.

Четвертый тип кометаболизма – синтаболизм – способность микроорганизмов расти на смеси двух или больше неростовых субстратов. Синтаболизм был выявлен у облигатных метанотрофов. Показано, что в определенных условиях они способны расти при наличии двух субстратов одновременно, каждый из которых сам по себе не является ростовым. В основе синтаболизма лежит способность метанотрофных бактерий сооокислять (вследствие неспецифичности метанмонооксигеназы) С₂Н₆ или СО. Установлено, что для прохождения реакции монооксигенирования С₂Н₆ необходима энергия, источником которой может служить окисленные производные метана или этана (метанол, формиат, этанол). Соответствующие эксперименты показали, что метанотрофы способны расти на этане (неростовой субстрат) в присутствии названных выше дополнительных неростовых субстратов.

Конечные продукты трансформации  могут использоваться другими микроорганизмами в сообществе. Конечные продукты кометаболизма сложно прогнозировать, но несколько типов эффектов можно представить: если косубстрат исходно токсичен, то в результате кометаболизма будет происходить его детоксикация. Конечные продукты кометаболизма будут поставлять питательные вещества для каких-нибудь других микроорганизмов и это может привести к большему биологическому разнообразию. Конечные продукты могут быть токсичными для данных продуцентов или других микроорганизмов и результатом этого может быть эффект ингибирования. Конечные продукты кометаболизма могут быть устойчивыми и это может быть результатом увеличения устойчивости конечных продуктов.

 

2.Влияние природы (структуры)  основного питательного субстрата  на образование и количество  тех или иных продуктов метаболизма (на примере культивирования тиамингетеротрофных дрожжей в условиях дефицита витамина В1).

По типу питания дрожжи Saccharomyces cerevisiae относятся к гетеротрофным организмам, т.е. утилизируют уже готовый органический субстрат, преобразуя его, и получая необходимый строительный материал и энергию для потребности клетки.

Как и все одноклеточные организмы, к которым относятся рассматриваемые  грибы, транспорт веществ в клетку происходит из раствора – среды, в которой обитают дрожжи, путем переноса различными механизмами внутрь клетки.

Для технологии бродильного производства – один из ключевых вопросов это  потребность культивируемого микроорганизма в различных соединения, возможность их замены, условия потребления из среды.

Существуют различия в потреблении  питания и факторов роста различными штаммами дрожжей. Однако, в производственных условиях необходимо принимать среднюю величину потребления при разработке комплекса дополнительного питания, активатора брожения как впрочем и других расходных материалов. Здесь необходимо учитывать, что в производстве, как пива, так и спиртовом, и производстве хлебопекарных дрожжей, идет постоянное изменение состава среды, в которой культивируются дрожжи. Задача элементов питания для естественных сред отличается от абсолютных значений, выведенных для культуры при выращивании на искусственных средах. В большинстве случаев расход дополнительного питания отрабатывается непосредственно на производстве, исходя из применяемой технологии, сырья, производственного штамма дрожжей.

Потребность в витаминах:

Дрожжи требуют в качестве факторов роста, как и любой другой организм определенного количества витаминов. Для Saccharomyces cerevisiae это витамины группы В. Рассмотрим потребности в витаминах, которые активно используют в дрожжевых подкормках, т.е. кормовые формы которых в настоящее время производятся в промышленных масштабах.

Тиамин или витамин В₁, образуется при конденсации пиримидинового ядра и ядра тиазола. Сульфит расщепляет тиамин на две составляющие и разрушает витаминную активность. Тиаминдифосфат (кокабоксилаза) представляет собой кофермент, требующийся для многих реакций декарбоксилирования, в частности – при протекании спиртового брожения для декарбоксилирования пировиноградной кислоты в ацетальдегид. Кроме того, тиамин регулирует конденсацию ацетоина и образование бутандиола-2,3.

Тиамин действует как активатор  брожения в отношении Saccharomyces cerevisiae. Добавление тиамина в сусло ограничивает процесс образования пировиноградной кислоты и, следовательно, степень связывания сернистого ангидрида.

 

3.Экзо- и эндометаболиты. Выбор способов разрушения клеточных стенок в зависимости от природы эндометаболита.

        Завершающей стадией любого микробиологического производства является выделение целевого продукта из культуральной среды и его очистка. Таким целевым продуктом может быть либо биомасса клеток, либо какой-то продукт клеточного метаболизма. Если целевой продукт находится внутри клетки (накапливается или входит в состав клеточных структур или оболочки), то он является эндометаболитом, если выделяется клеткой в культуральную жидкость - экзометаболитом. 

В большинстве случаев  извлечения эндометаболитов необходимо предварительное разрушение клеток. Однако этот процесс удобнее проводить не непосредственно в культуральной среде, извлекаемой из реактора, а с концентратом клеток после удаления культуральной жидкости. Поэтому первым этапом выделения большинства продуктов микробиологического синтеза является отделение биомассы микроорганизмов продуцентов из культуральной жидкости. При этом в зависимости от типа используемых микроорганизмов могут применяться самые различные методы.

Для разрушения (дезинтеграции) клеток применяют целый набор  методов, которые можно отнести  к трем основным группам: физико-механические, химические и энзиматические (ферментные) методы. Все процедуры должны быть достаточно жесткими, чтобы разрушить клеточную стенку, и в то же время достаточно мягкими, чтобы исключить денатурацию или разрушение целевого продукта. А поскольку клеточные стенки у разных микроорганизмов состоят из различных полимеров (иногда сопоставимых или превосходящих по прочности лучшие сорта сталей), то никакого универсального метода их разрушения не существует.  
К физическим методам относятся: разрушение клеток баллистическим способом с применением бус баллотини, кварцевого песка, растирание клеток в дисковой мельнице, дробление замороженных в жидком азоте или в сухом льде клеток; экструдирование клеток под высоким давлением (2-5 атм) через узкую щель или отверстие; газодекомпрессионная дезинтеграция, основанная на создании в камере с разрушаемым материалом высокого давления и быстрым сбросом его, приводящим к разрыву клеточных стенок; ультразвуковая дезинтеграция.

Энзиматические методы основаны на применении литических ферментов, разрушающих клеточную стенку: лизоцима, выделяемого из белка куриных яиц и разрушающего главным образом оболочки бактериальных клеток; ферментного комплекса, содержащегося в желудочном соке улитки Helix pomatia или продуцируемого некоторыми видами актиномицетов, лизирующего оболочки эукариотических клеток, в частности грибов. 
Химические методы дезинтеграции основаны на разрушении клеточной оболочки под воздействием щелочей, кислот, детергентов, ингибиторов синтеза оболочки клетки.

Выбор метода дезинтеграции  определяется целью работы: для получения  внутриклеточных ферментов наиболее приемлемы баллистические и экструзионные способы; энзиматические методы широко применяют в научных исследованиях для выделения в целости различных субклеточных структур (органелл, мембран и т.д.), а так же для получения протопластов. Применение химических методов дезинтеграции микроорганизмов ведет к нарушению целостности клеточных структур, инактивации ферментов. Поэтому химические методы обычно применяют для получения пищевого белка и биожира из дрожжей.

В результате обработки клеточной  биомассы по одному из методов дезинтеграции  получают гомогенат, содержащий неразрушенные клетки, оболочки разрушенных клеток, обрывки мембран, различные клеточные структуры, которые могут быть отделены путем фильтрования. При этом большая часть веществ-эндометаболитов переходит в культуральную жидкость или раствор экстрагента. 

Дальнейшее выделение  и очистка целевых продуктов  из культуральной жидкости или экстрактов зависит от их химической и физической природы. 
Для извлечения таких соединений, как спирты, карбонильные соединения, кислоты, их производные, большинство антибиотиков, витаминов, алкалоидов, применяют обычные приемы и методы, используемые в химической технологии (перегонку, выпаривание, экстракцию, перекристаллизацию, возгонку и др.). В качестве примера приведем технологию экстракционного выделения бензилпенициллина из культуральной жидкости.

 

 

4.Достоинства и недостатки непрерывного способов культивирования.

При непрерывном способе  культивирования микроорганизмы постоянно  получают приток свежей стерильной питательной  среды, а из аппарата непрерывно отбирается биомасса вместе с образуемыми метаболитами (такой способ культивирования можно  назвать «открытой» системой). При  непрерывном культивировании микроорганизмы не должны испытывать недостатка в питательном субстрате, так как скорость его притока сбалансирована со скоростью выхода биомассы. Кроме того, культура не отравляется продуктами обмена веществ – в этом большое преимущество непрерывного способа культивирования по сравнению с периодическим, преимущество «открытой» системы по сравнению с «закрытой». Непрерывная ферментация может проходить в гомогенной системе идеального смешения, системе полного вытеснения и ли системе твердожидкостного типа.