Контрольная работа по «Биотехнология»

К биологическим мутагенам  относят ДНК- и РНК-содержащие вирусы, некоторые полипептиды и белки, например О-стрептолизин и ряд ферментов рестриктаз, а также препараты некоторых ДНК и определенные плазмиды. Механизмы образования мутаций при действии различных биологических факторов не вполне ясны, однако агенты, содержащие нуклеиновые кислоты, могут вызывать нарушение процессов рекомбинации, что приводит к возникновению мутаций. Действие рестриктаз сводится к «разрезанию» цепей ДНК в месте (локусе) определенной последовательности нуклеотидов, специфичном для каждой рестриктазы.

Для устранения первичных  повреждений генетических структур, вызванных мутагенами, в клетке существует ряд систем восстановления, или репарации, генетических повреждений. В настоящее  время таких систем насчитывается  более десяти. Однако в ходе репарации  часть первичных повреждений  может остаться и привести к возникновению  мутаций.

По характеру изменения  генотипа различают генные (точечные, или точковые) мутации, хромосомные мутации и геномные мутации. Генные мутации представляют собой наследственные, микроскопически невыявляемые изменения в хромосомах. При использовании высокоразрешающих методов анализа хромосом у человека установлено, что природа ряда мутаций, ранее считавшихся генными. приводящих, например, к появлению ретинобластом, синдромов Лангера — Гидиона, Прадера — Вилли и др., состоит в делении (потере) участка хромосомы. Истинно генные мутации связаны либо с заменой пары азотистых оснований в полинуклеотидной цепи ДНК, что было впервые установлено для серповидно-клеточной анемии у человека, либо с вставкой или выпадением нескольких отдельных нуклеотидов, характерных для мутаций типа сдвига «рамки считывания».

Частота возникновения спонтанных генных мутаций составляет от 10^-5 до 10^-7. Так как общее количество генов у человека равно в среднем 100 000, то в каждой клетке (индивиде) в течение онтогенеза появляется одна новая мутация.

Хромосомные мутации (хромосомные  аберрации) разделяют на внутрихромосомные и межхромосомные. К внутрихромосомным мутациям относят делецию (утрату части хромосомы), дупликацию (удвоение части хромосомы) и инверсию (изменение последовательности расположения генов по длине хромосомы за счет перевертывания — инверсии — участка хромосомы на 180°). Различают парацентрическую инверсию, при которой инвертируется участок хромосомы внутри одного ее плеча, не затрагивая центромеры, и перицентрическую инверсию, когда инвертированный участок захватывает центромеру. К межхромосомным мутациям относят транслокации — обмен участками между двумя хромосомами. Если при этом происходит слияние двух остатков хромосом, каждый из которых содержит центромеру, возникает дицентрическая хромосома (дицентрик). При обмене участками двух плечей одной и той же хромосомы со слиянием ее проксимальных концов образуется кольцевая хромосома.

Геномные мутации заключаются  в изменении числа хромосом, в  кариотипе. Увеличение числа хромосом, кратное гаплоидному набору хромосом, называют полиплоидией. Отсутствие или  избыточное количество отдельных хромосом объединяют понятием «анэуплоидия», которую подразделяют на гиперплоидию (увеличение числа хромосом) и гипоплоидию (потерю отдельных хромосом хромосомного набора). Геномные мутации возникают за счет повреждений в процессе мейоза, ведущих к нерасхождению хромосом или хроматид по дочерним клеткам. Общая частота геномных и хромосомных мутаций в соматических клетках человека составляет около 1%, а в зародышевых — около 0,5%.

Мутации гена, приводящие от нормального к новому состоянию, называют прямыми, а от мутантного фенотипа к исходному (реверсия гена) — обратными. Действие мутаций универсально для всех организмов.

Биологические эффекты мутаций  делят на эффекты, проявляющиеся  в соматических клетках и приводящие к возникновению синдромов поражения  органов и тканей, и эффекты, проявляющиеся  изменениями в зародышевых клетках, в результате чего возникают несущие  мутацию половые клетки — гаметы. Мутации, возникающие в половых  клетках или клетках полового зачатка, называют генеративными, а  в клетках, других тканей — соматическими. Генеративные мутации проявляются  в следующем поколении в виде изменения фенотипа всего организма  и передаются в последующие поколения. Действие соматических мутаций при возникновении их на ранних стадиях эмбриогенеза ведет к появлению пороков развития. Соматические мутации могут также играть роль одного из пусковых механизмов развития опухолей.

Действие мутагенов, рассеянных в окружающей среде, вызывает увеличение частоты возникновения мутаций, что ведет к росту так называемого генетического груза, выражающегося в увеличении наследственной патологии, а также частоты онкологических заболеваний.

Использование индуцированного  мутагенеза в селекции растений:

Искусственно полученные мутантные формы являются ценным материалом для селекции, поскольку  в контролируемых условиях можно  получить мутации, встречающиеся в  природе очень редко или вообще не обнаруживаемые. Мутагенез широко применяется в селекции микроорганизмов  и растений.

Для получения индуцированных мутаций у растений используют самые  различные мутагены. Дозу этих мутагенов  подбирают таким образом, чтобы  погибало не более 30…50% обработанных объектов. Например, при использовании ионизирующего излучения такая критическая доза составляет от 1…3 до 10…15 и даже 50…100 килорентген. При использовании химических мутагенов применяют их водные растворы с концентрацией 0,01…0,2%; время обработки – от 6 до 24 часов и более.

Обработке подвергают пыльцу, семена, проростки, почки, черенки, луковицы, клубни и другие части растений. Растения, выращенные из обработанных семян (почек, черенков и т.д.) обозначаются символом M₁ (первое мутантное поколение). В M₁ отбор вести трудно, поскольку большая часть мутаций рецессивна и не проявляется в фенотипе. Кроме того, наряду с мутациями часто встречаются и ненаследуемые изменения: фенокопии, тераты, морфозы.

Поэтому выделение мутаций  начинают в M₂ (втором мутантном поколении), когда проявляется хотя бы часть рецессивных мутаций, а вероятность сохранения ненаследственных изменений снижается. Обычно отбор продолжается в течение 2…3 поколений, хотя в некоторых случаях для выбраковки ненаследуемых изменений требуется до 5…7 поколений (такие ненаследственные изменения, сохраняющиеся на протяжении нескольких поколений, называют длительными модификациями).

Полученные мутантные  формы или непосредственно дают начало новому сорту (например, карликовые томаты с желтыми или оранжевыми плодами) или используются в дальнейшей селекционной работе.

Однако применение индуцированных мутаций в селекции все же ограничено, поскольку мутации приводят к  разрушению исторически сложившихся  генетических комплексов. У животных мутации практически всегда приводят к снижению жизнеспособности и/или  бесплодию. Поэтому в селекции стараются  использовать уже известные мутации, которые прошли испытание естественным отбором.

7.Биотехнологические векторы.

Биологические (биотехнологические) векторы – это биологические структуры, способные вносить чужеродный генетический материал в клетку: плазмиды, бактериофаги, вирусы.

Термин "вектор" применяется  в науке обычно в тех случаях, когда надо подчеркнуть существование  определённого направления.

Так что уже по смыслу термина можно понять, что биологические векторы  направляют искуственно внедрённую в них ДНК в интактные клетки-мишени. Для введения небольшого количества ДНК в древние прокариотические безядерные клетки обычно используют плазмиды, и этот процесс совершается с помощью хлорида кальция (CaCl2). Такая плазмидная система биовекторов работает очень хорошо для небольшого количества генетического материала, т.к. сами плзмиды - это небольшие молекулы. А вот для более крупных генов уже требуются другие векторы.

Биологические (биотехнологические) векторы – это биологические структуры, способные вносить чужеродный генетический материал в клетку. К ним относятся: 1) плазмиды, 2) бактериофаги, 3) вирусы.

Эти биовекторы используются для переноса в чужую клетку искусственно изменённой ДНК, которая называется рекомбинантной.

Рекомбинантная ДНК - это модифицированная молекула ДНК, полученная за счёт объединения ин витро («в пробирке», в искусственных условиях) разнородых фрагментов ДНК, которые нигде в природе не существуют совместно.

Например, рекомбинантной ДНК называют плазмиду, в которую встроен участок ДНК, чужеродной для бактерии.

Плазмиды (эписомы) - это отдельные кольцевые молекулы ДНК у бактерий, которые определяют внехромосомную наследственность бактериальной клетки и предсталяют собой генетический элемент, способный к длительному автономному существованию и репликации. Обычно это двухцепочечная кольцевая ДНК длиной 1-200 т.п.н. (тысяч пар нуклеотидов).

Количество плазмид у бактерии может быть разное, и чем больше плазмид, тем они мельче.

Плазмиды передают генетическую информацию от "своих" бактерий всем другим бактериям, даже если эти бактерии относятся к другим семействам. Они содержат информацию о ферментах, обеспечивающих приспособление к использованию конкретного субстрата в качестве источника питания или о ферментах, обеспечивающих устойчивость бактерий к различным неблагоприятным факторам среды: антибиотикам, ксенобиоикам и пр.

Обычно плазмиды захватываются бактериями из окружающей среды и используются ими уже в качестве своих собственных дополнительных источников генетической информации.

Т.к. бактерии в норме захватывают  плазмиды из окружающей среды, то плазмиды используются в биотехнологии в качестве векторов: в них встраивают нужные гены и таким образом эти гены вместе с плазмидой внедряются в бактерию и начинают в ней действовать.

В качестве векторов в биотехнологии  используются не только плазмиды, но также вирусы и бактериофаги.

Бактериофаки как биовекторы

Особенно удачный вектор был  сконструирован на основе такого бактериофага, как  колифаг λ. Фаг λ — умеренный колифаг с длинным несократительным хвостовым отростком и днДНК геномом размером 48 502 п.н. Центральная часть генома фага несущественна для его функционирования и используется для заместительной вставки клонируемой ДНК по единственному сайту узнавания для рестриктазы EcoRI. Сам по себе этот вектор короток для упаковки в головку фага (размеры головки накладывают ограничение не только на максимальную, но и на минимальную длину генома). Таким образом, чтобы получить фаг, способный размножаться с образованием зрелых фаговых частиц, в разрезанный родительский вектор должен быть непременно встроен фрагмент чужеродной ДНК. Это приводит к образованию автоматической селективной системы для отбора химерных фаговых геномов. Для удобства отбора рекомбинантных фагов в несущественную область генома, используемую для вставки, введен ген lacZ. Рекомбинантные фаги отбирают из зон лизиса бактериального газона, имеющих белый цвет. Фаг M13 — нитевидный колифаг, имеющий кольцевой онДНК-геном. Для получения рекомбинантных ДНК используют репликативную форму фага, представляющую собой кольцевую двухнитевую ДНК размером 6400 п.н., в которую вставлен ген lacZ, содержащий полилинкер сайтов для целого ряда рестриктаз. Рекомбинантные фаги отбирают из зон лизиса бактериального газона, имеющих белый цвет. Использование векторов на основе фага M13 имеет ряд положительных моментов. Так, одно клонирование дает два вида фагов с однонитевым ДНК-геномом. Каждый вид фага содержит только одну из нитей вставки ДНК, которые могут находиться в разных ориентациях. В связи с этим, клонирование с использованием фага M13 удобно для создания однонитевых ДНК-зондов и секвенирования ДНК. Попытка объединить преимущества плазмидных и фаговых векторов привела к созданию космид. Это плазмиды со встроенными специфическими последовательностями ДНК (cos — сайтами), отвечающими за Упаковку ДНК фага λ в фаговой частице. Такие векторы могут существовать в бактерии в виде плазмид, но могут быть выделены в чистом виде путем их упаковки в фаговые частицы in vitro. Ценность космидных векторов заключается в их большой емкости — то есть в возможности клонирования вставок большого размера. На длину этих векторов также накладываются ограничения, обусловленные размером головки фага, но в таком геноме не обязательно присутствие генов, необходимых для литического цикла.

8.Иммуноферментный анализ (ИФА). Достоинства и недостатки метода.

Иммуноферментный  анализ, или ИФА (англ. Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, ELISA) — это лабораторный иммунологический метод качественного определения и количественного измерения антигенов, а также иммуноглобулинов и гормонов.

Метод ИФА обладает высокой  чувствительностью и специфичностью, которая в настоящее время  составляет более 90%.

Тест-системы для иммуноферментной диагностики выявляют широкий круг различных инфекций: ВИЧ-инфекция, вирусные гепатиты, цитомегаловирусная, герпесная, токсоплазменная и др.

Метод иммуноферментного  анализа (ИФА) дает возможность определения  антител (IgG, IgA, IgM) к возбудителям инфекции в крови. Эти антитела вырабатываются организмом в ответ на инфицирование. Антитела выявляются при взаимодействии со специальными препаратами, содержащими соответствующие антигены, образующие с антителами прочный комплекс, который можно обнаружить разными способами.

В основе метода лежит принцип  взаимодействия иммуносорбента — антигена возбудителя инфекции с выявляемыми антителами. В зависимости от того, какие антитела использованы, тест-система будет выявлять в исследуемом образце или специфические антитела независимо от их класса, или антитела лишь определённого класса. Материалом для исследования служит сыворотка или плазма венозной крови, взятой натощак.

Для диагностики венерических заболеваний используются три класса иммуноглобулинов: M, A, G.

Благодаря тому, что иммуноглобулины  разных классов вырабатываются в  определенной последовательности, с  помощью ИФА можно диагностировать  инфекцию на разных стадиях, и отслеживать  динамику развития процесса.

Последовательность выработки  иммуноглобулинов разных классов следующая:

     1. Первыми появляются IgM-антитела. Как правило, это происходит через 1–3 недели с момента заражения. Время обнаружения антител зависит как от самой инфекции, так и от особенностей иммунной системы конкретного человека. Появляются симптомы острой инфекции. Обнаружение IgM-антител в анализе указывает на наличие острой фазы заболевания или на обострение хронических инфекционных заболеваний.

    2.Через месяц начинают вырабатываться IgA-антитела, основная часть которых концентрируется на слизистых оболочках, где реализуется их защитная функция.

   3.Последними появляются IgG-антитела, как правило, на 4 неделю с момента заражения. После лечения хламидиоза, микоплазмоза, трихомониаза их уровень значительно снижается, так как иммунитет против этих заболеваний не развивается.