Контрольная работа по «Биотехнология»

4.1. Гомогенные системы идеального смешения. В системе идеального смешения микроорганизмы растут в культуральной среде, постоянной по своему составу, и, следовательно, в каждый данный момент времени находятся в одном и том же физиологическом состоянии, то есть в состоянии установившегося динамического равновесия. По количеству ферментеров гомогенные системы могут быть одностадийными, двухстадийными и многостадийными.  
Для получения высоких концентраций биомассы используют одностадийные системы с возвратом клеток, в которых клетки, отделенные от культуральной жидкости с помощью насоса, возвращают обратно в ферментер. Возврат клеток (рециркуляция) имеет важное значение в тех процессах, в которых за время пребывания в ферментере клетки не успевают реализовать свои потенциальные возможности в отношении синтеза целевого продукта. 
 Многостадийные системы состоят из ряда последовательно соединенных ферментеров – батареи. Применение многостадийных систем позволяет получать культуру при любой скорости роста – от лаг-фазы до экспоненциальной и стационарной. Многостадийное культивирование применяется при получении молочной кислоты, этилового спирта. 
        Основным аппаратом для выращивания непрерывной гомогенной системы является ферментер идеального смешения с устройством для потока среды и слива культуры, поддерживающим постоянный уровень среды. Такой процесс называют непрерывно-проточным, обеспечивающим одинаковую концентрацию всех продуктов внутри ферментера и в вытекающей жидкости.

Непрерывно-проточное культивирование  дает возможность поддерживать постоянные условия роста микроорганизмов  за счет лимитирования (ограничения) какого-то одного фактора среды. В случае, когда лимитирующим рост фактором является химический состав питательной среды, процесс называют хемостатным культивированием. В хемостате (ферментере, где протекает хемостатное культивирование) скорость разбавления питательной среды является постоянной в соответствии с заданной плотностью популяции. Изменяя скорость разбавления, можно получать режимы, обеспечивающие различную скорость роста. 
Другой принцип управления процессом – турбидостат. В нем подача питательной среды осуществляется по команде фотоэлектрического элемента, регистрирующего оптическую плотность культуры в ферментере. Скорость разбавления устанавливается автоматически в соответствии с заданной плотностью популяции.

Хотя теоретически взаимосвязь  между концентрацией биомассы и  скорость разбавления подчиняется  одним и тем же закономерностям  в хемостате и турбидостате, методы управления процессами различны. 
      4.2. Системы культивирования полного вытеснения. Открытая система полного вытеснения отличается от системы идеального смешения тем, что культура в ней не перемешивается, а представляет собой поток жидкости через трубку. Наиболее распространенным аппаратом для культивирования в данном случае является трубчатый ферментер. Он может иметь различную форму (прямую, S-образную, спиральную) и устанавливается горизонтально или вертикально. Система полного вытеснения представляет собой пространственный, проточный вариант периодической культуры. Такая культура за время посева до выгрузки проходит через все стадии периодической культуры, то есть фазы роста распределены не во времени, а в пространстве, причем каждой части ферментера в установившемся режиме соответствует определенный отрезок кривой роста. Этот способ культивирования используется для анаэробных процессов. Посев осуществляется непрерывно на входе в ферментер одновременно с подачей среды. Этот принцип может использоваться на стадии брожения при производстве пива.

4.3. Системы твердожидкостного типа. К системам твердожидкостного типа относят многофазные системы, в которых культура растет на границе разных фаз: жидкость – твердая фаза - газ. В этих системах клетки удерживаются путем прилипания к твердой основе – наполнителю и размножаются на нем, образуя пленку биомассы. Типичным примером является производство уксуса в стружечных аппаратах. 
В данной системе лимитирующим фактором для аэробных микробов являются кислород и субстрат (питательные вещества). В тонких пленках каждая из прикрепленных в поверхности клеток полностью обеспечена этими веществами и способна расти и размножаться с максимальной экспоненциальной скоростью. По мере того, как клетки образуют более толстую пленку биомассы, рост их ограничивается (верхним слоям не хватает кислорода, нижним – питательных веществ). 
Культивирование микроорганизмов, образующих пленку из биомассы, осуществляется в ферментере типа колонки с наполнителем. В качестве наполнителя может использоваться макроноситель (кокс, прутья, стружка, стеклянные шарики и т.д.) и микроноситель (амберлитовые смолы, частички сефадекса и т.д.). Клетки, культивируемые таким образом, называют иммобилизованными. Использование иммобилизованных клеток имеет несколько преимуществ.

Во-первых, появляется возможность  длительной эксплуатации клеток в случае непрерывной ферментации.

Во-вторых, известны примеры  повышения устойчивости клеток к  действию различных неблагоприятных  внешних факторов (температуры, кислотности, концентрации токсичных веществ и других) в результате иммобилизации.  
В-третьих, существенно упрощаются процедуры выделения используемых клеток и культуральной жидкости, содержащей целевой продукт.  
В-четвертых, благодаря применению иммобилизации обычно снижаются энергозатраты на процесс в целом: за счет уменьшения (а следовательно, и удешевления) размеров применяемых ферментеров; а также за счет упрощения процедур выделения и очистки конечного продукта. 
В промышленной микробиологии системы твердожидкостного типа нашли применение при очистке сточных вод, в производстве органических растворителей и кислот и т.д.

5.Протопласты. Способы получения. Особенности культивирования. Протопласт (от др.-греч. πρῶτος — «первый» + πλαστός — образованный, вылепленный и др.) — содержимое растительной илибактериальной клетки, за исключением внешней клеточной оболочки(клеточной стенки), однако при сохранении клеточной (плазматической) мембраны.

Протопласт - клетка, лишенная целлюлозной оболочки, окруженная цитоплазматической мембраной, сохраняющая все свойства, присущие растительной клетке. Впервые  протопласты в 1892 г. выделил Дж. Клеркер, который использовал механический способ. При этом способе у плазмолированных клеток разрезают клеточную стенку, протопласты выходят в среду. В настоящее время метод претерпел модификации, улучшен, но имеет ряд ограничений:

• невысокая производительность,
• можно использовать ткани только с экстенсивным плазмолизом,
• трудоемкость и длительность.

     Другой метод выделения протопластов - энзиматический, с использованием ферментов. В 1952 году Салтон с помощью фермента лизоцима впервые разрушил клеточную стенку бактерий. В 1960 году Коккинг обработал кончики корней томата гидролитическим ферментом из культуральной жидкости плесневых грибов (Myrothecium verrucaria) и впервые получил изолированные протопласты высших растений энзиматическим способом.

Преимущества энзиматического метода по сравнению с механическим:

• одновременно выделяется большое количество протопластов (до 10 млн. из грамма ткани или клеток),
• клетки не подвергаются сильному осмотическому стрессу,
• клетки не повреждаются,
• метод сравнительно быстрый.

Для удаления клеточной стенки используют ферменты трех типов: целлюлазы, гемицеллюлазы и пектиназы. Комбинация ферментов и их соотношение специфично для каждого типа клеток.

Выделение протопластов проводят в три этапа:

     1.обработка ферментами,

     2.выделение протопластов из клеточных стенок,

     3.отделение интактных протопластов от клеточных осколков.

Стандартная методика протопластов (по Такебе) из тканей листа Nicotiana tabacum:

Зрелый, сформировавшийся лист отделяют от взрослого растения в  возрасте 60 - 80 дней, окунают в 70% этанол, а затем помещают на 15 - 20 минут  в 10% раствор гипохлорита кальция  и многократно промывают дистиллированной водой. С помощью пинцета нижний эпидермис снимают, очищенные от эпидермиса листья разрезают скальпелем на небольшие кусочки площадью 4 кв. см. Для лучшего снятия эпидермиса листья должны немного подвянуть, можно также ограничить снабжение водой перед срезанием листьев.

Далее ткань обрабатывают последовательно или одновременно пектиназой, вызывающей мацерацию, и целлюлазой, разрушающей клеточные стенки. Оптимальная концентрация ферментов, как и время обработки, индивидуальны для разных тканей. Протопласты должны находиться в растворе ферментов минимальное количество времени, после чего следует тщательная промывка. Ферменты стерилизуют через бактериальные фильтры.

Регуляция водообмена клетки связана с наличием клеточной стенки. Когда протопласт "голый", один из компонентов регуляции водообмена теряется, поэтому важное значение приобретают осмотические свойства среды выделения и культивирования. Среда должна быть немного гипертонической, чтобы протопласты находились в слегка плазмолизированном состоянии. Эти условия тормозят метаболизм и регенерацию клеточной стенки. В качестве осмотических стабилизаторов используют сахара (глюкозу, маннит, сорбит, ксилозу), ионные осмотики (CaCl₂, KCl) в концентрации 0,3 - 0,8 моль/литр. Концентрации подбираются индивидуально для каждого растительного объекта.

Удобнее обрабатывать ткани  ферментами в чашке Петри, которую  держат под углом 15^о. Смесь ферментов с протопластами переносят в центрифужные пробирки. Отделить протопласты от ферментативной смеси можно двумя способами: либо фильтрация с центрифугированием, либо флотация.

При фильтрации смесь пропускают через фильтры с размерами  пор 40 мкм. На фильтре при этом остаются комки клеток и их большие осколки. При дальнейшем центрифугировании  оседают протопласты, осколки остаются в супернатанте. При повторном центрифугировании идет отмывка от фермента, после чего протопласты переносятся в среду для культивирования.

Метод флотации предложен  О. Гамборгом с сотрудниками в 1981 году, и предназначается для ослабленных протопластов. Он основан на том, что протопласты имеют более низкую плотность, чем органеллы или остатки клеточных стенок. К исходной смеси добавляют раствор сахарозы и центрифугируют при скорости от 40 – 80 до 350 g. Чистые протопласты плавают, осколки оседают на дно.

Протопласты можно выделять также из суспензионных и клеточных  культур. Лучше всего - в поздней  стадии логарифмического роста, когда  клеточные стенки легче поддаются  разрушению, протопласты наиболее жизнеспособны.

Далее протопласты культивируют в тех же условиях, что и клетки. Состав солей может быть несколько  изменен. Среда состоит из осмотического  стабилизатора, неорганических соединений, источника углерода, азота, витаминов, фитогормонов. Условия культивирования: рН среды 5,4 - 5,8, температура 22 - 28^оС, невысокая освещенность (не более 2000 лк).

Способы культивирования  протопластов

Существуют два способа  культивирования протопластов: метод  жидких капель и метод платирования.

В первом случае суспензию  протопластов в виде капель помещают на пластиковые чашки Петри. Вариацией  этого способа является культивирование  единичных изолированных протопластов в микрокаплях объемом 1 мкл, предложенное Ю. Глебой в 1978 г.

Во втором - суспензию  протопластов наливают в пластиковые  чашки Петри, добавляют равный объем  той же среды с 1% агаром при температуре не выше 45^оС. После остывания чашки Петри переворачивают и культивируют при 28^оС. В данном случае протопласты фиксированы в одном положении и физически отделены друг от друга. Это дает возможность наблюдать за развитием интактного протопласта: формированием клеточной стенки, делением, ростом и развитием растения. Вариантом этой техники является использование кормящих протопластов или клеток, подвергнутых воздействию рентгеновского или γ-излучения, что блокирует их способность к делению. Такие протопласты или клетки смешивают с жизнеспособными протопластами и они поддерживают и стимулируют их рост.

Сразу после удаления раствора фермента начинается образование клеточной  стенки. Труднее добиться деления  клеток и регенерации растений. Регенерация  растений осуществляется либо через  эмбриогенез, либо через развитие каллуса  с дальнейшей индукцией морфогенеза. Добиваются этого добавлением в  среду ауксинов или сочетания  ауксинов с цитокининами.

На пролиферацию клеток, возникших из протопластов, влияет 4 фактора:

-видовая специфичность и физиологическое состояние исходной ткани растения,

-способ и условия выделения протопластов,

-плотность высева протопластов,

-состав питательной среды.

6.Мутагенез. Основные типы мутагенезов. Мутагенез в селекции.  

Мутагене́з [мутация (от лат. mutatio изменение) + греч. gennaō рождать, производить] — возникновение мутаций — внезапных качественных изменений генетической информации. В качестве синонима понятия «мутагенез» часто используют понятие «мутационный процесс». Однако содержание последнего термина более широкое. Под мутационным процессом, как правило, подразумевают не только процесс возникновения мутаций, но и их накопление. распространение и элиминацию. Новые мутации являются источником мутационной изменчивости и чрезвычайно важны с точки зрения профилактики и лечения наследственных болезней Мутагенезом в ряде случаев называют также раздел генетики предметом изучения которого являются закономерности образования мутаций,

Термин «мутация» был  предложен голландским ученым де Фрисом (Н. de Vries) в 1901 г. Различают спонтанные мутации, возникающие с относительно низкой частотой, а также индуцированные мутации, вызываемые воздействием мутагенных агентов (мутагенов). Существует три группы мутагенов: физические, химические и биологические. К физическим мутагенам относят нагревание, различные виды ионизирующих излучений (рентгеновское, α- β- и γ-лучи, нейтроны, мезоны и другие элементарные частицы и ионы высоких энергий), а также ультрафиолетовое и микроволновое излучение. Мутагенное действие характерно для Уф-лучей с длиной волны от 250 до 280 нм. Первичный эффект ионизирующих и ультрафиолетовых излучении заключается в образовании одиночных или двойных разрывов в молекуле ДНК.

Мутагенным действием  обладают многие химические соединения самого разнообразного строения. Наибольшую мутагенную активность проявляют различные  алкилирующие соединения, а также нитрозосоединения, некоторые антибиотики, обладающие противоопухолевой активностью. Химические мутагены делят на мутагены прямого действия, непосредственно взаимодействующие с генетическим материалом клетки, и мутагены непрямого действия, влияние которых на генетический материал клетки происходит опосредованно, после ряда метаболических превращений. Установлено, что мутагенной активностью обладает несколько тысяч химических соединений. Однако в отличие от ионизирующего и ультрафиолетового излучений для химических мутагенов характерна специфичность действия, зависящая от природы объекта и стадии развития клетки. При взаимодействии химических мутагенов с компонентами наследственных структур (ДНК и белками) возникают первичные повреждения последних. В дальнейшем эти первичные повреждения ведут к возникновению мутаций.