Опухоли детского возраста

Заболеваемость злокачественными опухолями детском возрасте сравнительно невелика и составляет в среднем 10-12 на 100.000 детского населения. Однако среди причин смертности в экономически развитых странах злокачественные опухоли занимают первое место среди детей старше 5 лет.  
Структура злокачественных опухолей у детей резко отличается от таковой у взрослых. Если для взрослых наиболее характерны раки различых органов, т.е. опухоли эпителиальной природы, то у детей рак - это казуистика и опухоли детского возраста в подавляющем большинстве имеют неэпителиальную природу.  
 
Опухоли детского возраста можно разделить на три большие группы:  
 
1.Эмбриональные опухоли. Возникают в результате ошибочного развития эмбриональных клеток, ведущее к персистированию и пролиферации клеток, схожих с тканями плода.  
 
2.Ювенильные опухоли. Эти опухоли возникают из-за злокачественной трансформации в клетках зрелых тканей, но возникают преимущественно в юношеском возрасте.  
 
3.Опухоли взрослого типа. Эти опухоли редко встречаются у детей и их гистологическая структура идентична таковым у взрослых.  
 
Сравнительные данные по частоте злокачественных опухолей у детей в различных странах и среди различных расовых групп трудно интерпретировать, поскольку уровень развития раковых регистров в разных странах различен. До последнего времени считалось, что частота опухоли Вилмса у детей приблизительно одинакова во всех странах и показатель заболеваемости этой опухолью являлся маркером качества регистрации опухолей в этой стране. Однако, недавно выяснилось, что в Японии заболеваемость опухолью Вилмса достоверно ниже, чем повсюду.  
Существуют значительные различия в частоте той или иной опухоли у детей разных расовых и этнических групп, чаще всего эти различия пока необьяснимы. Так например, по данным из США первый "пик" заболеваемости ОЛЛ в 2-3 года регистрируется у маленьких американцев кавказского происхождения и не регистрируется у детей афро-карибского происхождения. У детей азиатского происхождения болезнь Ходжкина чаще регистрируется в младшем возрасте с преобладанием смешанно-клеточного варианта поражения. Среди старших детей восточно-индийской популяции опухоль Вилмса регистрируется намного чаще, чем во всех остальных странах, тогда как у азиатских детей эта опухоль встречается относительно редко. Саркома Юинга - очень редкое заболевание у чернокожих американцев.  
В связи с редкостью злокачественных опухолей у детей трудно выявить влияние факторов окружающей среды на возникновение различных неоплазий. Первое место по частоте во всем мире занимают лейкемии, с частотой 4-4,5 на 100.000 детей, составляя приблизительно одну треть всех злокачественных опухолей у детей. ОЛЛ встречается в 5-6 раз чаще, чем ОМЛ. Мальчики и девочки заболевают практически одинаково часто с небольшим преобладанием мальчиков, однако по данным американских исследователей риск заболеть Т-клеточной лейкемией у мальчиков в 4 раза выше, чем у девочек, тогда как на первом году жизни лейкемия чаще диагностируется у девочек (1,5:1). Практически во всех странах отмечается "пик" заболеваемости ОЛЛ между 2 и 5 годами жизни, тогда как для ОМЛ характерен "пик" на первом году жизни с постепенным снижением частоты заболеваемости к 4 годам, после чего уровень заболеваемости остается стабильным на протяжении всего детского возраста.  
Лейкемия, как самая частая злокачественная опухоль у детей, привлекает внимание исследователей для попытки выявления специфических факторов окружающей среды, влияющих на возникновение опухоли. Между тем, групповые заболевания лейкемией могут случайно возникать в областях, где отсутствуют все отрицательные гипотетические факторы.  
Географические особенности частоты лейкозов иллюстрируют примеры: согласно существующим регистрам заболеваемость ОЛЛ колеблется от 45 на 1 миллион в Коста-Рике, до 7 и 12 на 1 миллион в Индии и Кувейте соответственно. Для ОМЛ: заболеваемость от 1 на миллион в Кувейте до 12 на миллион в Шанхае. За последние два десятилетия отмечается рост заболеваемости ОЛЛ особенно в возрастной группе от 0 до 4 лет.  
 
Этиология лейкемий в детском возрасте. 
 
Генетические синдромы. 
Описано несколько генетических синдромов, которые связаны с повышенной заболеваемостью лейкемиями. По данным разных авторов риск заболеть ОЛЛ или ОнеЛЛ для детей с синдромом Дауна в 10-20 раз выше, чем в нормальной популяции детей аналогичного возраста. Более того, по данным некоторых авторов, риск заболеть особым подтипом ОнеЛЛ, а именно, М7, повышен у таких детей в 600 раз. До сих пор до конца не ясно, почему дети с синдромом Дауна имеют такой высокий риск заболеваемости ОЛ, хотя результаты исследований последних лет показали, что ген (AML-1), связанный с определенными типами ОнеЛЛ, идентифицирован на группе хромосом 21q22, области, как хорошо известно, ответственной за фенотип синдрома Дауна. Другие генетические синдромы связанные с повышенной заболеваемостью острыми лейкемиями, включают нейрофиброматоз, Синдром Блума, Синдром Швахмана, атаксию-телеангиоэктазию и синдром Кляйнфельтера. Некоторые синдромы связаны с определенным типом ОЛ, как например, Лангергансово-клеточный гистиоцитоз - с ОЛЛ, болезнь Костмана (врожденная нейтропения) и анемия Фанкони - с ОнеЛЛ. Более того, существуют семейные формы ОнеЛЛ (семейная моносомия 7), когда дети в одной семье заболевают лейкемией в возрасте до 20 лет. Однако, лейкемии, развивающиеся в "рамках" синдромов встречаются гораздо реже, чем спорадические случаи заболевания. Также известно о повышенной семейной заболеваемости лейкемиями, что может быть связано, как с генетической предрасположенностью так и с влиянием факторов окружающей среды. Хорошо известны факты о заболеваемости ОЛ близнецов (особенно монозиготных), что в большой степени зависит от возраста и особенно заметно у детей до года. Существуют данные о том, что в этих случаях эта конкордантность связана, главным образом, не с генетической предрасположенностью, а с плацентарной циркуляцией, т.е. возможно, в этих случаях имеет место внутриутробная экспозиция лейкемогенных факторов.  
 
Вес при рождении.  
По крайней мере в 9 исследованиях указывается, что дети с высоким весом при рождении имеют в 2 раза больший риск заболеть ОЛЛ и наоборот, среди заболевших ОЛЛ практически не встречалось маловесных детей. Однако эти исследования касались только развития ОЛЛ у детей до года. Относительно других возрастных групп достоверных данных о повышенном риске заболеваемости детей ОЛЛ в связи с весом при рождении нет.  
 
Радиация. 
Считается, что внутриматочное облучение плода при диагностических рентгенологических исследованиях значительно повышает риск заболевания лейкемией для будущего ребенка. Однако, в настоящее время в силу чрезвычайно малого числа женщин, которые подверглись диагностическому исследованию во время беременности, этот фактор, как реальная причина заболеваемости может быть практически незначимым. Однако большой интерес представляет влияние предшествующего облучения на риск развития лейкемии у потомства. Существуют прямо противоположные данные о роли предшествующего облучения родителей: одни свидетельствуют о повышенном риске для детей, другие этой связи не видят. Однако отсутствие повышенного уровня заболеваемости лейкемиями у потомков, выживших после атомных бомбардировок, по-видимому, сводят этот риск к нулю. Постнатальное диагностическое облучение также, по-видимому, не повышает риск заболевания, хотя хорошо известно, что лечебная лучевая терапия (даже по поводу незлокачественных процессов, как например, гиперплазия тимуса) может стать причиной развития не только лейкемий, но и других злокачественных опухолей (см. "Поздние осложнения лечения").  
Влияние электромагнитных полей на развитие детских лейкемий в настоящее время интенсивно изучается в ряде стран (США, Германия, Канада и Великобритания), поскольку существуют данные, свидетельствующие о влиянии электромагнитных полей на развитие нейробластом у детей.  
 
Паталогия беременности. 
Существует, по крайней мере, 4 исследования в которых демонстрируется связь повышенной заболеваемости ОЛЛ и ОнеЛЛ у детей, матери которых имели в анамнезе выкидыши, что может быть связано с однотипным влиянием факторов окружающей среды или с врожденным генетическим дефектом. Однако, исследования такого рода продолжаются и окончательные выводы еще предстоит сделать в будущем.  
 
Aлкаголь и курение. 
В настоящее время имеются четкие данные о риске заболевания ОнеЛЛ детьми (особенно очень маленьких), матери которых употребляли алкоголь во время беременности. В частности, исследованиями последних лет установлено, что этот риск особенно велик для некоторых типов ОнеЛЛ (М1 и М2). Более того, указывается также и на умеренный риск заболевания ОЛЛ. Однако ряд исследователей не видят связи между употреблением матерью алкоголя и заболеваемостью ОЛЛ.  
Относительно влияния курения данные тоже противоречивы: некоторые исследователи обнаружили связь с повышенной заболеваемостью ОЛ, тогда как другие этой связи не находят.  
 
Химические агенты.  
Известно, что работа родителей с пестицидами (профессионально или при использовании их в домашних условиях) повышает риск заболевания детей как ОЛЛ так и ОнеЛЛ, причем особенно эта связь отмечена для маленьких детей с ОнеЛЛ - М4/М5 подтипами. Работа родителей с различными растворителями также достоверно связана с повышенным риском заболеваемости ОЛ их детей, хотя в одном исследовании эта связь отвергается. В настоящее время этот вопрос также усиленно изучается в ряде стран.  
 
Другие факторы. 
Существует ряд менее документированных связей, как например, курение матерью марихуаны (риск ОнеЛЛ), возрастом матери, употреблением ребенком хлорамфеникола. Диета (как матери, так и ребенка), как фактор риска развития ОЛ, интенсивно не изучалась. Одно недавнее исследование, проведенное в США, выявило повышенный риск для ОЛЛ среди детей, употребляющих большое количество "hot dog" и гамбургеров, хотя, конечно, это могло быть и случайным совпадением. Другое исследование выявило снижение риска заболеваемости лейкемиями при длительном употреблении в пищу масла тресковой печени. Поскольку этиология детских лейкемий в большей степени неизвестна, необходимы дальнейшие исследования в этом направлении, что и происходит в ряде развитых стран мира.  
 
Медикаменты. 
В настоящее время известно только два лекарства достоверно и значительно повышающие риск возникновения злокачественных опухолей у детей. Это диэтилстилбоэстрол, который вызывает карциному влагалища и нитрозоамины, которые увеличивают риск заболевания опухолями головного мозга. Есть ряд работ (правда на небольшом по численности материале), которые указывают на связь опухолей и некоторых медикаментов: фенитоин, барбитураты, диуретики. Хлорамфеникол, который ныне редко применяется у детей, может повысить риск заболеваемости ОЛ. Длительное лечение андрогенами, принятое раньше при анемиии Фанкони, связано с высоким риском развития гепатобластомы. Сами цитостатики, используемые для лечения опухолей могут стать причиной развития вторичной опухоли: алкилирующие агенты и эпиподофиллотоксины ответственны за возникновение вторичных лейкемий (главным образом миелоидных).  
 
Инфекции. 
Роль, которую играет вирус Эпшейн-Барра (EBV) в эволюции некоторых опухолей, интенсивно изучается. Наиболее известные примеры этого влияния - назофарингеальный рак и лимфома Бёркита. Считается, что EBV может индуцировать процесс "бессмертия" (т.е. индуцировать способность клеток к саморепродукции) в клетках, подвергшихся спонтанным цитогенетическим мутациям. Этот процесс и лежит в основе дисрегуляции роста. Хотя большинство детей с гепатоцеллюлярной карциномой и не имеют в анамнезе вирусный гепатит В, связь этих двух событий признается очень тесной.  
Очень много работ обсуждают роль инфекции в патогенезе лимфогранулематоза. С этой точки зрения интересен тот факт, что в развивающихся странах, где высок уровень инфекционной заболеваемости среди маленьких детей, регистрируется более раннее начало болезни Ходжкина, чем в развитых странах. Предполагают, что заболевание лимфогранулематозом в более старшем возрасте в развитых странах связано с отсутствием раннего контакта с патогеном.  
 
Генетические факторы. 
Структурные хромосомные аномалии часто находят в опухолевых клетках, и это может отражать нестабильность в процессе быстрого роста и деления опухолевой популяции, а не первичный дефект, вовлеченный в патогенез. (см. главу " Цитогенетический метод"). Существует ряд наследственных заболеваний, при которых имеется высокий риск возникновения злокачественных опухолей. (Табл.3). Для большинства из этих заболеваний механизм этой связи неясен.  
 
Ретинобластома - это, пожалуй, единственная опухоль детского возраста, когда существует реальная наследственная связь, выявляемая примерно в 1/3 случаев. При опухоли Вилмса менее 1% случаев могут быть наследственными. Есть сообщения о наследовании нейробластомы и гепатобластомы. В отношении других солидных опухолей риск заболеть злокачественной опухолью для сиблинга считается вдвое большим, чем в обычной популяции, но все же этот риск ничтожно мал, чтобы оправдать скрининг сиблингов, хотя этот вопрос часто волнует родителей заболевшего ребенка. Интересен один семейный раковый синдром, синдром, Li-Fraumeni, при котором заболеваемость рабдомиосаркомой у детей коррелирует с заболеваемостью раком молочной железы у матерей. В этих семьях также описана высокая частота сарком мягких тканей, опухолей цнс и адренокортикальной карциномы. Риск возникновения остеосаркомы, рака легкого и рака гортани также может быть повышен. Предполагают, что примерно 1% всех детских злокачественных опухолей - это проявление синдрома Li-Fraumeni.

Успех лечения злокачественной опухоли во многом зависит от точной диагностики, основы которой составляет определение природы злокачественного процесса, выявляемой морфологически, иммунологически и генетически, и установление степени распространенности процесса, т.е. стадии.  
Уже при первом контакте с больным часто удается заподозрить природу патологического процесса, и определить алгоритм детального обследования. При сборе анамнеза часто сразу можно выделить главные жалобы и ведущие симптомы, которые могут сразу нацелить на определенное заболевание, и обычные рутинные процедуры могут дать много информации о предполагаемом заболевании. В таблице 2-1 представлены наиболее часто встречающиеся симптомы некоторых опухолей.Ультразвуковое исследование (УЗИ) брюшной полости и забрюшинного пространства.  
Безвредный неинвазивный метод, который может дать достаточно информации об источнике опухоли, вовлечении лимфатических узлов и инвазии крупных сосудов. Появление в клинической практике цветных Doppler ультразвуковых аппаратов сделало этот метод высокоинформативным, особенно при выявлении инвазии сосудов при опухоли Вилмса или гепатобластоме. В таблице 2-2 представлены дифференциальные диагнозы при абдоминальных находках разной локализации.  
УЗИ грудной клетки иногда необходимо для различения характера новообразования (жидкость или солидное), что не всегда убедительно ясно даже при КТ.  
УЗИ способно выявить метастазы в печени, поражение печени при грибковой инфекции.  
УЗИ яичек может подтвердить клиническое предположение о поражении при лимфомах и лейкемиях. Посредством УЗИ можно определить природу некоторых мягкотканных образований, таких как доброкачественные кисты или варикоцеле.  
 
Рентгенография. 
Прямая и боковая рентгенограммы грудной клетки. В таблице 2-3 представлены дифференциальные диагнозы при выявленной патологии при рентгенографии грудной клетки.  
Обзорная рентгенография брюшной полости. 
Этот метод может выявить смещение петель кишечника в сторону, противоположную локализации объемного процесса, может выявить кальцификаты в патологическом образовании, что типично для нейробластомы и может встречаться при герминогенных опухолях. Гораздо реже кальцификация встречается при других абдоминальных опухолях у детей.  
 
Рентгенограммы костей. 
Высокоинформативный метод дифференциальной диагностики опухолей костей. На рентгенограмме должны быть оценены характер деструкции костной ткани, степень распространения внутри кости, реакция надкостницы, выход процесса в мягкие ткани. Признаки, характерные для конкретных нозологических форм будут рассмотрены в специальной главе.  
 
Внутривенная урография. 
Имеет большую ценность при диагностике опухоли Вилмса, ее главная роль- оценить функцию контралатеральной почки.  
 
Компьютерная томография(КТ). 
Это самый информативный метод исследования в онкологии. Ему принадлежит ведущая роль при установлении распространения опухоли и при оценке ответа опухоли на лечение. С помощью КТ можно обследовать любой участок тела. Его разрешающая способность много выше, чем обычной рентгенографии; так, например, КТ выявляет микрометастазы в легких, невидимые при рентгенографии. Поэтому КТ грудной клетки абсолютно обязательна при первичном обследовании больных с остеогенной саркомой, саркомой Юинга, опухолями печени, герминогенными опухолями, опухолью Вилмса. КТ маленьких детей должна проводиться под наркозом.  
 
Ядерно-магнитный резонанс= магнитно-резонансная томография(ЯМРТ). 
Этот высокочувствительный метод несет ту же информацию, что и КТ. однако при ряде заболеваний его использование предпочтительнее. При исследовании задней черепной ямки или основания черепа с помощью КТ качество изображения обычно страдает из-за костных артефактов, поэтому при локализации опухолей в этих областях рекомендуется ЯМРТ. ЯМРТ успешно заменила инвазивные процедуры обследования при патологии спинного мозга и других интравертебральных процессах.  
Характер ЯМР-сигнала может характеризовать природу некоторых сарком мягких тканей. Определение минимальной остаточной опухоли ЯМРТ регистрирует более точно, чем КТ. ЯМРТ способна демонстративно выявить метастазы солидных опухолей в костный мозг, равно как и вовлечение костного мозга при лимфопролиферативных заболеваниях. ЯМРТ с контрастом используется для более точного установления местного распространения опухоли, что чрезвычайно важно перед оперативным вмешательством.  
 
Радиоизотопные исследования. 
Остеосцинтиграфия с 99 Технецием - информативный метод при обследовании больных с опухолями, потенциально метастазирующими в кости. Поэтому этот метод исследования обязателен при первичном обследовании больных с нейробластомой, рабдомиосаркомой, саркомой Юинга, остеосаркомой. Поражение скелета может также регистрироваться при лимфомах и лейкемиях. Остеосцинтиграфия более чувствительный метод, чем рентгенография, она выявляет злокачественное поражение костей на 4-6 мес. раньше, чем рентген. Исключение составляет гистиоцитоз из клеток Лангерганса, при котором изотоп практически не накапливается в очагах и для выявления поражения необходимо проведение рентгенографии наиболее часто вовлекаемых в патологический процесс участков скелета.  
 
Сцинтиграфия с 67 Ga проводится у больных с лимфопролиферативными заболеваниями. Изотоп накапливается в пораженных лимфатических узлах. Нужно, однако, помнить, что галлий могут накапливать и воспаленные ткани, и доброкачественная гиперплазия тимуса. Важно, поэтому, соотносить данные изотопного исследования с данными КТ и ЯМРТ и клинической картиной заболевания.  
 
Специфическое исследование с Мета-йодбензилгуанидином, меченным радиоактивным йодом подробно описано в главе, посвященной нейробластоме.  
 
Радиоизотопные методы используются и для проведения некоторых функциональных проб. Ренография позволяет оценить функцию почек перед проведением интенсивной химиотерапии и оценить селективную функцию почек при их поражении.  
 
Верификация злокачественных процессов. 
 
Совершенно очевидно, что точно верифицированный диагноз является краеугольным камнем в онкологии вообще и в детской онкологии в частности. Специфическое лечение (химиотерапия, лучевая терапия) может быть начато только после установления диагноза злокачественного процесса. Вид лечения и его интенсивность зависят в первую очередь от биологии злокачественной опухоли. Для выяснения ее природы необходимо достаточное количество биологического материала, получаемого путем пункций и биопсий.(см. главу "Хирургический метод"). И если при лейкемиях основную диагностическую информацию можно получить в течение суток, то при солидных опухолях диагностический процесс требует нескольких дней.  
 
Для верификации диагноза в онкологии используются следующие методы:  
1.Светооптическая микроскопия (цитологическое и гистологическое исследования после стандартных окрасок);  
2. Электронная микроскопия;  
3. Иммунологические исследования (иммунофлуоресценция, иммуноцитохимия и иммуногистохимия);  
4. Цитогенетика;  
5. Молекулярная биология.  
 
2.1. СВЕТООПТИЧЕСКАЯ МИКРОСКОПИЯ 
 
Значение светооптической микроскопии в детской онкологии имеет большое значение прежде всего в связи с тем, что в результате цитологического или гистологического исследования пунктатов, биопсийного или операционного материала клиницисты получают диагноз, определяющий дальнейшую лечебную тактику. Клеточный или тканевой состав опухоли, степень злокачественности, характер роста, наличие метастазов определяют выбор лечения и прогноз. В свою очередь, для постановки развернутого гистологического диагноза решающее значение имеет качество обработки материала. Кроме того, важно исследовать не только саму опухоль, но и орган, в котором она расположена, для выявления фоновых изменений, что облегчает понимание развития опухолевого процесса. Для приготовления препаратов, пригодных для светооптической микроскопии, биопсийный или операционный материал должен пройти три основных этапа обработки: фиксацию, заливку и окраску.  
 
Фиксация. 
Первым этапом обработки образцов тканей является фиксация. Для качественной фиксации материала необходимо вырезать кусочки исследуемой ткани толщиной 3-5 мм. Наиболее распространенной и универсальной является фиксация в 10% нейтральном формалине в течение 10-24 часов. При изучении трепанобиопсий подвздошной кости с целью состояния костного мозга, материал в течение 1,5-2 часов фиксируется в жидкости Карнуа: спирт абсолютный - 6 частей, хлороформ - 3 части, уксусная кислота (ледяная) - 1 часть.  
 
Заливка. 
Фиксированные кусочки исследуемой ткани, после дегидратации, погружаются в очищенный, гомогенизированный парафин. Использование парафина является достаточным для получения срезов толщиной 5 мкм, необходимых для светооптической микроскопии. В последние годы в гистологической практике нашли применение специальные смолы (метакрилаты). При погружении в них практически отсутствует артефакт сморщивания исследуемой ткани. Кроме того, этот метод позволяет получить полутонкие срезы, а также позволяет изготовлять гистологические препараты костной ткани без предварительной декальцинации. При погружении в парафин материала при остеогенных опухолях и трепанобиопсий необходима предварительная декальцинация. Это осуществляется различными методами с использованием органических и неорганических кислот. Одним из оптимальных методов является декальцинация в жидкости де Кастро. Для приготовления 100 мл декальцинирующей жидкости необходимо: хлоралгидрат - 5 г, спирт абсолютный - 30 мл, азотная кислота концентрированная - 8 мл, вода дистиллированная - 57 мл.  
 
Окрашивание. 
Для подавляющего большинства диагностических светооптических исследований используются простые окраски: гематоксилин-эозин, азурII-эозин, Ван Гизон, судан, импрегнация азотнокислым серебром, ПАС-реакция. В тех случаях, когда на основании простых методов окрашивания не удается установить полноценный цитологический или гистологический диагноз, используются методы электронной микроскопии, иммуноцитохимии и иммуногистохимии.

Страница 160

2.2. ЭЛЕКТРОННАЯ  МИКРОСКОПИЯ 
 
В настоящее время метод электронной микроскопии более эффективно используется в научных исследованиях посвященным патогенетическим и патофизиологическим процессам опухолевого роста, однако в дифференциальной диагностике онкологических заболеваний у детей этот метод имеет свое применение как дополнительный к световой микроскопии для уточнения некоторых диагнозов. Так например: нейробластома легко диагностируется, когда в опухолевых клетках выявляются плотные стержневидные гранулы; рабдомиосаркому характеризует наличие в клетках миофиламентов; диагноз острого мегакариоцитарного лейкоза подтверждает присутствие специфических тромбоцитарных гранул; Лангерганс-клеточный гистиоцитоз ассоциируется с появлением в клетках гранул Бирбека. При других онкологических заболеваниях также имеются различные ультраструктурные особенности, но они носят неспецифический характер и могут иметь место при различных опухолях. В последнее время рекомендуется проводить электронную микроскопию в сочетании с иммуноцитохимией, но, к сожалению, в России этот метод не имеет широкого применения из-за отсутствия наработанных стандартов и специфичности.  
 
Этапы обработки и подготовки исследуемого материала для электронной микроскопии аналогичны этапам для светооптической микроскопии, но для проведения ультраструктурного исследования необходимо знать следующее:  
1. Размер тканевых кусочков для электронной микроскопии должен быть 1-2 мм3;  
2. Тканевых кусочков должно быть несколько и выделять их желательно из различных участков биопсийного материала;  
3. Фиксация исследуемого материала осуществляется в 2,5% растворе глютаральдегида на какодилатном буфере и в 1% растворе четырехокиси осмия на том же буфере;  
4. Время фиксации должно быть не менее 6 часов;  
5. Заливка исследуемого материала осуществляется в специальную смесь эпоксидных смол;  
6. Окрашивание производиться солями тяжелых металлов - уранилацетат и цитрат свинца;  
7. Изготовление ультратонких срезов осуществляется с помощью ультрамикротомов, а срезы монтируются на специальные микросеточки;  
8. Окончательное заключение о патологическом процессе не должно основываться только на ультраструктурном исследовании без световой микроскопии.  
 
2.3. ИММУНОФЛУОРЕСЦЕНЦИЯ И ИММУНОЦИТОХИМИЯ  
 
Иммунофлуоресценция и иммуноцитохимия (ИФА и ИЦХА соответственно) - методы, применяемые в клинической патологии человека.  
 
Для иллюстрации мы воспользовались собственными примерами иммунофлуоресцентного и иммуноцитохимического анализа мононуклерных субпопуляций при клинических исследованиях иммунофенотипа лейкемий у детей. Каждый из последовательно описанных здесь методов являются как бы ступенью к более полной оценке клеточных фенотипов.  
 
В современном ИФА используются микроскопы с освещением препарата сверху и комплекты селективных светофильтров для регистрации зеленой флуоресценции изотиоцианат флуоресцеина (ФИТЦ) и красной флуоресценции изотиоцианат тетраметилродамина (ТРИТЦ). Тот же комплект светофильтров позволяет одновременно наблюдать оранжевое свечение еще одного флуорохрома, фикоэритрина (ФЭ). Флуоресцентномикроскопическое исследование мембранных и цитоплазматических маркеров клетки, как правило, сочетается с цитологическим анализом при помощи фазовоконтрастной оптики, позволяющей исследователю отличить типичные лимфоциты от гранулоцитов, моноцитов, больших гранулярных лимфоцитов и лимфобластов. Фазовоконтрастная микроскопия клеток может иметь самостоятельное значение для цитологической диагностики, а флуоресцентная микроскопия помимо визуального выявления флуоресцирующих мембранных и цитоплазматических маркеров может служить методом предварительной оценки клеточных взвесей перед количественной проточной цитофлуориметрией.  
 
ИЦХА так же, как и ИФА, довольно часто используется в цитологической диагностике и в исследовательской работе. Методы исследования на основе ИЦХА и ИФА взаимно дополняют друг друга и во многих лабораториях в зависимости от характера исследуемых проблем применяются и те и другие методы.  
 
Иммунофлуоресцентное маркирование клеток 
в пробирках для микротитрования (микропанельный ИФА).  
 
Специфические моноклональные антитела (МКА) связываются с мембранными антигенами живых клеток, находящихся в суспензии. Чтобы предотвратить кэппинг и шеддинг (слущивание) антигенов после взаимодействия с антителами, к суспензии клеток добавляют 0,2% азида натрия. В прямых методах ИФА используют специфические к клеточным антитенам антитела, конъюгированные с флуоресцентной меткой, и маркирование клеток производят как одноэтапную реакцию. В непрямых методах ИФА в качестве первых антител используют немеченые антитела к клеточным антигенам, а в качестве вторых - меченные флуорохромом антитела к иммуноглобулинам. Маркирование клеток производят в два этапа. Вторые антитела служат для выявления связанных с клеткой первых антител. Непрямые методы обычно чувствительнее прямых.  
 
Использование предназначенных для микротитрования пластиковых микропробирок позволяет одновременно производить ИФА значительного числа образцов клеток, применяя многочисленные образцы МКА. Перенесенные на каждое стекло 8-12 капель клеточных взвесей в глицериновом буфере оседают на поли-L-лизин и исследуют под микроскопом. Используют фазовоконтрастный объектив с просветленной оптикой, увеличением 63х и числовой аппертурой 1,3-1,4, безупречно скорригированной изготовителем.  
 
Микропанельный ИФА специально предназначен для исследования антигенов лимфоцитарных мембран и диагностики лейкемий. Однако в связи с тем, что он гораздо экономичнее других модификаций ИФА по расходу реагентов, исследуемых клеток и времени, его можно приспособить для решения других экспериментальных задач особенно в тех случаях, когда требуется исследовать одновременно много образцов суспензий, содержащих ограниченное число клеток.  
 
Распределение флуоресцентных меток на клеточной мембране весьма тонко характеризует ее морфологию. Присутствие азида предотвращает кэппинг и шединг антигенов, но движения мембраны, например образование пэтчей, все же происходит, и благодаря им удается идентифицировать клетки по цитологическим различиям распределения маркера. Так, образование пэтчей отличается от появления "гранулярных" скоплений метки в результате связывания иммунных комплексов* с Fc-рецепторами. Гомогенное же распределение метки по клеточной мембране свойственно нефиксированным погибшим клеткам, связывающим меченые антитела неспецифически.  
(Cледует пунктуально производить процедуру отмывания клеток (т.е. 
число ресуспендирований и осаждений), так как следовые количества МКА 
в надосадочной жидкости могут прореагировать с антителами к 
иммуноглобулинам с образованием растворимых комплексов, 
которые будут связываться с Fc-рецепторами клеток, на самом деле не 
экспрессирующих выявляемый антиген)  
 
Набор образцов МКА, предназначенный для диагностики лейкозов состоит из реагентов, специфичных к дифференцировочным антигенам стволовых гемопоэтических клеток, клеток миелоидного ряда, а также Т- и В-клеток. Чтобы установить принадлежность лейкозных клеток к определенному гемопоэтическому ростку и идентифицировать ту стадию дифференцировки, на которой прекратилось их созревание, нужно располагать целым набором МКА, обеспечивающих надежное фенотипирование клеточноспецифических антигенов. Вместе с тем, система идентификации клеток должна обладать известной широтой, чтобы выявлять разнообразные отклонения исследуемых клеток от нормальной постадийной динамики антигенного фенотипа. Результатом таких отклонений иногда могут быть идиосинкратические фенотипы лейкозных клеток, которые помимо этого имеют множественные хромосомные аберрации. Поэтому именно микропанельный ИФА с одновременным использованием целого набора МКА и быстрым получением разнообразной информации позволяет избежать ошибочных оценок фенотипических данных, а также дает возможность провести дополнительное иммунофенотипирование с любой новой комбинацией реагентов. 
Иммуноцитохимический анализ цитологических препаратов. 
 
Основанные на реакции антиген-антитело методы микроскопического выявления и идентификации молекулярных компонентов клеток называют иммуноцитохимическими. В качестве реагентов для выявления клеточных антигенов в большинстве случаев используют специфические МКА, которые после связывания с антигеном устанавливают прямым или непрямым методом по метке. Меткой служат конъюгированные с антителами ферменты или флуорохромы. Как уже указывалось выше, непрямой метод обнаружения клеточных антигенов, основанный на использовании вторых антител, чувствительнее прямого. Используя аффинные взаимодействия типа фермент-антитела к нему или комплекс биотина, конъюгированного с ферментом авидином, можно достичь еще большего увеличения чувствительности. При постановке иммуноцитохимических методов требуется прежде всего так фиксировать исследуемый клеточный материал, чтобы в клетках сохранялась нативность выявляемых антигенов.  
 
Пероксидаза хрена (ПХ) в присутствии небольшого количества перекиси водорода катализирует окисление 3,3'-диаминобензидина (ДАБ) с образованием нерастворимого золотисто-коричневого продукта. Если ПХ непосредственно или опосредовано присоединить к антителам, то эта реакция может происходить лищь там, где меченные ферментом антитела связались с антигеном.  
 
При микроскопии окрашенных препаратов на фоне обычной цитологической картины, например костного мозга, можно идентифицировать коричневый продукт ферментативной реакции, образовавшийся в местах связывания использованных антител с выявляемыми антигенами.  
 
Иммуноферментное маркирование можно осуществлять при помощи комплекса щелочная фосфатаза-антитела к щелочной фосфатазе (ЩФ-АЩФ). Принцип маркирования тот же самый, что и при использовании иммунопероксидазной метки. Конечный продукт ферментативной реакции имеет хорошо заметный красивый красный цвет.  
 
Результаты микроскопического исследования препаратов, маркированных ЩФ, интерпретируют таким же образом, как и при маркировании пероксидазой. Использование комплексов ЩФ-АЩФ, особенно при повторных циклах нанесения, повышает чувствительность иммуноферментного анализа до уровня иммунофлуоресцентного и выше. Причины слабого окрашивания определенных антигенов при использовании того или другого иммуноцитохимического метода не всегда понятны. Следует отметить, что можно достичь оптимального выявления различных клеточных антигенов, применяя в одних случаях комплексы ЩФ-АЩФ, а в других ИФА.  
 
При использовании флуоресцентной метки можно различить поверхностную и цитоплазматическую локализацию выявляемых антигенов. Ферментные метки этого не позволяют. В некоторых случаях суспендированные клетки можно проинкубировать с МКА, конъюгированными с ферментом, приготовить из взвеси мазки и определить затем локализацию антител с помощью соответствующего субстрата. При этом возможно выявление некоторых поверхностных антигенов.  
 
Преимущества и недостатки разных методов выявления клеточных антигенов, в том числе авидин-биотинового и стрептавидин-биотинового, подробно описаны в специальных руководствах.  
 
Двойное маркирование клеток. 
 
Цель двойного маркирования - это выявление двух различных антигенов на одной клетке. Для его осуществления можно воспользоваться двумя образцами флуорохромированных первых антител, например конъюгированными с ФИТЦ козьими антителами к c-цепям и конъюгированными с ТРИТЦ козьими антителами к l-цепям человека, или двумя образцами мышиных моноклональных антител разного изотипа, которые затем выявляются вторыми класс- и субкласс-специфическими антителами к мышиным иммуноглобулинам, конъюгированными с разными флуорохромами.  
 
Интерпретация результатов двойного иммунофлуоресцентного маркирования не вызывает затруднений. Поочередно используя комплекты светофильтров для ФИТЦ и ТРИТЦ, можно определить, маркирована ли данная клетка антителами одной или двух специфичностей. В то же время интерпретация результатов двойного иммуноферментного маркирования не столь проста. Клетки, меченные пероксидазой, приобретут золотисто-коричневую окраску, а меченные щелочной фосфатазой - голубую (диазоль синий вместо диазоля красного). Обе метки одновременно окрашивают клетку в розовато-лиловый цвет. Вместе с тем клетка имеющая оба антигена может быть ошибочно отнесена к обладающим лишь одним антигеном из-за того, что какой-либо из них экспрессирован с гораздо большей плотностью, чем другой.  
 
В заключение следует отметить, что двойное маркирование с обязательным контролем специфичности реагентов, используемых в непрямом двухцветном ИФА, позволяет выявлять уникальные фенотипические характеристики клеток в норме и при патологии. Результаты такого анализа можно использовать при выделении из крови, лимфы, костного мозга или тканей, интересующих исследователя, редко встречающихся клеток для функционального изучения in vitro, которое будет способствовать раскрытию взаимосвязей между функциями клеточных субпопуляций и их фенотипическими характеристиками.  
 
2.4. ИММУНОГИСТОХИМИЯ  
 
Иммуногистохимия (ИГХ) - это метод выявления и точной локализации того или иного клеточного или тканевого компонента (антигена) in situ с помощью иммунологических и гистохимических реакций. Авторами этого метода по праву считается группа исследователей под руководством Альберта Кунса, которые впервые получили меченные флюоресцеином антитела и применила их в диагностических целях. Более широкое распространение ИГХ получила в 70-е годы после публикации Taylor и Burns, продемонстрировавших наличие иммуноглобулинов в плазматических клетках. Последующие годы были отмечены не только совершенствованием самого метода, но и расширением сфер его применения.  
 
Основой ИГХ является реакция антигена и антитела. В качестве антигена может выступать практически любой клеточный или тканевой компонент: структурные белки клеток, поверхностные гликопротеины лимфоцитов, рецепторы гормонов, ростовые факторы и их рецепторы, коллаген IV типа, ламинин, онкопротеины, вирусные белки и т.д.. После иммунизации лабораторного животного антигеном его В- лимфоциты начинают синтез антител, причем каждый клон В-лимфоцитов способен вырабатывать антитела лишь к одному типу эпитопов. В настоящее время используются как сыворотки иммунизированных животных, содержащие смесь антител к нескольким эпитопам, производимые многими клонами- такие антитела называют поликлональными, так и моноклональные антитела, как правило мышиные (Рис.2.4-1). Моноклональные антитела не содержат примесей, которые могут встречаться в сыворотке, и, главное, они высоко специфичны.  
 
При встрече антигена и специфичного ему антитела происходит их связывание, задачей гистохимических реакций, которые включаются в процесс на этом этапе, является сделать продукт реакции антиген- антитело видимым для глаза. Для достижения этой цели используются метки разного типа. Флюоресцентные метки используются и сейчас, однако использование их в широкой практике ограничено. Более широкое применение получили методы ИГХ с использованием ферментных меток. Ферменты, присоединенные (конъюгированные) к антителам запускают каскад гистохимических реакций с хромогеном, приводящих, в конечном счете, к образованию некого окрашенного продукта, расположенного в местах локализации иммунного комплекса. Чаще всего таким ферментом-маркером служит пероксидаза хрена, которую впервые применили для целей ИГХ Накане и Пирс. В качестве хромогена, с которым вступает в реакцию пероксидаза, широко используется ДАВ. Полученные препараты стабильны и могут длительно храниться, они доступны для просмотра в обычном светооптическом микроскопе. Применяются также и другие ферментные метки- щелочная фосфатаза, глюкозооксидаза и т.д., которые требуют использования соответствующих хромогенов.  
 
Все иммуногистохимические техники можно разделить на 2 группы: методы с меченными и немечеными антителами, отличающиеся по степени чувствительности. Чувствительность метода определяется количеством молекул пероксидазы, участвующих в реагировании. Наиболее чувствительным в настоящее время следует признать авидин-биотиновый метод и его разновидности.  
 
Можно выделить следующие основные сферы применения ИГХ в диагностической практике:  
 
1. Диагностика опухолей неясного генеза. 
Обычное гистологическое исследование не всегда может ответить на вопрос о происхождении (гистогенезе) опухоли. Во многих подобных случаях правильно подобранная панель антител может помочь установить правильный диагноз. При ИГХ диагностике опухолей можно использовать алгоритм, предложенный D. Mason(1987).  
 
Опухоль, экспрессирующая цитокератины или Антиген эпителиальных мембран (ЕМА), имеет эпителиальное происхождение, либо содержит эпителиальный компонент. Цитокератины-- это группа водо-растворимых внутриклеточных пептидов, присутствующих практически во всех эпителиальных клетках. По молекулярному весу все цитокератины могут быть подразделены на низко- и высокомолекулярные, которые также различаются по порядковым номерам. Каждый вид эпителия экспрессирует свой специфический набор кератинов, обычно от 2 до 10. Состав этого набора зависит не только от вида эпителия, но также от стадии эмбрионального развития, клеточного окружения, а в случае рака и от степени дифференцировки. Существует множество антител к цитокератинам, но в обычной диагностической практике используют анти-панцитокератин, пригодный для выявления большинства раков. В таблице 2.4-1 представлены результаты тестирования антител к панцитокератину, проведенного на большом количестве опухолей разного гистогенеза. Наличие в группе кератин-позитивных опухолей ряда опухолей неэпителиального происхождения обусловлено тем, что мезенхимальные клетки обладают возможностью экспрессировать кератины в норме на определенных этапах филогенеза, а также транзиторно при опухолевой трансформации. Кроме цитокератинов, для диагностики эпителиальных опухолей используется также антиген эпителиальных мембран (ЕМА), гликопротеин, присутствующий во многих эпителиальных клетках. Данное антитело обладает меньшей специфичностью, чем цитокератины, однако может заменить его в ситуации, если активность кератинов была уничтожена вследствие неоптимальной фиксации. Необходимо помнить о том, что экспрессия ЕМА отмечается в ряде опухолей лимфоидного происхождения высокой степени злокачественности. Экспрессия опухолью Общелейкоцитарного антигена (LCA) говорит о ее гемопоэтическом происхождении. LCA- это высокомолекулярный гликопротеин, который содержится в большом количестве в наружных клеточных мембранах практически всех клеток лимфоидного и костномозгового происхождения. Экспрессия этого антигена не отмечена в нормальных или опухолевых клетках другого происхождения, поэтому данный антиген является важным дискриминирующим фактором, особенно, при проведении дифференциального диагноза между недифференцированным раком, амеланотической меланомой и крупноклеточной лимфомой.  
 
Белок S-100 - это растворимый белок, выделенный из ткани головного мозга, и, как первоначально предполагалось, специфический маркер глиальных клеток. В настоящее время имеются данные об экспрессии белка S-100 меланоцитами, клетками Лангерганса, гистиоцитами, хондроцитами, липоцитами, скелетными и сердечными мышечными клетками, Шванновскими клетками, эпителием и миоэпителием молочных, слюнных и потовых желез, и, соответственно, опухолями из указанных клеток. Наибольшее распространение белок S-100 имеет для диагностики меланом, однако, учитывая широкий характер экспрессии этого антигена его надо применять только в панели с другими антителами. Еще одним антигеном, пригодным для подтверждения меланомы, служит меланомо-специфический антиген (HMB-45), находящийся в премеланосомах. ИГХ диагноз амеланотической меланомы можно сформулировать, как опухоли негативной к кератинам и LCA, но позитивной к S-100, HMB-45 и виментину.  
 
Десмин- это промежуточный филамент гладко,- поперечно- полосатых и сердечных мышечных клеток. Синтез десмина начинается в ранний период дифференцировки миобласта и предшествует появлению других структурных белков, например, миоглобина. Десмин используется для верификации опухолей мышечного генеза, таких как лейо- и рабдомиосаркомы. Актин- это сократительный белок, который имеет 6 изоформ, из которых a- форма присутствует только в мышечных клетках, тогда как другие присутствуют в клетках не- мышечного происхождения. Использование моноклональных антител к a- форме актина позволяет отдифференцировать миогенные опухоли.  
 
Нейрогенные и близкие им по гистогенезу опухоли экспрессируют целый ряд антигенов, которые используются для диагностики. Среди них нейрофиламент - промежуточный филамент нейронов, нейрон- специфическая энолаза, синаптофизин. Нейрон-специфическая энолаза - это один из изоэнзимов энолазы, состоящий из 2(единиц. Она содержится в большом количестве в нейронах и клетках нейроэндокринного происхождения. Синаптофизин, белок пресинаптических пузырьков нейронов, также является чувствительным маркером невральной и нейроэндокринной дифференцировки. Опухоли чисто нейрогенного происхождения экспрессируют все или часть из перечисленных маркеров, но негативны к цитокератину. Если же опухоль дополнительно экспрессирует цитокератин, то это свидетельствует в пользу нейроэндокринной природы. Примером такого рода опухолей может служить нейроэндокринный рак кожи или опухоль Меркеля, карциноиды. В качестве дополнительного маркера в подобных случаях можно использовать антитела к хромогранину А- члену семьи родственных белков, входящих в состав матрикса нейросекреторных гранул, а также присутствующего практически в клетках всех эндокринных желез. Глиальные клетки синтезируют глиальный фибриллярный кислый белок.  
 
Виментин -это промежуточный филамент, который экспрессируется большинством клеток мезенхимального происхождения. Первоначальные исследования давали возможность предположить, что виментин является специфическим маркером и позволит проводить дифференциальный диагноз между опухолями не-эпителиального и эпителиального генеза. Более поздние данные указывают, что экспрессия виментина не имеет рестрикции к опухолям из клеток мезенхимального происхождения, но также закономерно встречается в раках, меланомах. Эпителиальные клетки могут экспрессировать виментин при культивировании in vitro, a in vivo этот феномен отмечается у раковых клеток, находящихся в экссудатах. Таким образом, экспрессия виментина как единственного маркера имеет небольшое диагностическое значение, но при использовании его в панели с другими антителами и в соответствующем гистологическом контексте, он может стать дискриминирующим фактором.  
 
Следует отметить, что в настоящее время существует очень ограниченное количество органо-специфических антител, из которых можно упомянуть антитела к простата-специфическому антигену, простатической кислой фосфатазе, тиреоглобулину. Применение этих антител может помочь при решении вопроса о источнике метастаза.

Страница 161

2.Определение  клональности. 
К сожалению, возможности ИГХ для решения задач такого типа не велики, т.к. в настоящее время иммуногистохимические маркеры клональности для большинства опухолей неизвестны. Однако, существует надежный тест определения клональности В-лимфоцитов и плазматических клеток. Как известно, каждый лимфоцит/ плазмоцит может кодировать и экспрессировать один из типов легких цепей- каппа или лямбда и в норме в лимфузлах могут обнаружены клетки обоих типов в соотношении k(каппа):l(лямбда)=2:1, т.е. популяция в норме поликлональна. В случае опухолевой трансформации, отмечается рост клеток одного из типов при вытеснении, а позднее и полном исчезновении клеток другого типа, т.е. популяция становится моноклональной. Т.о. окрашивание с антителами к легким цепям может быть использовано для дифференциального диагноза между реактивной гиперплазией лимфузла и начальными стадиями фолликулярной лимфомы (по экспрессии поверхностных Ig лимфоцитами) или реактивного плазмоцитоза и миеломы (по экспрессии цитоплазматических Ig плазматическими клетками).  
 
3. Обнаружение небольшого количества клеток. 
Подобная необходимость возникает при исключении микрометастазирования в лимфузлах и костном мозге. Кроме того, ИГХ используется для быстрого выявления клеток Штернберга при лимфогранулематозе (ЛГР),при диагностике вирусных поражений.  
 
4. Окрашивание стромальных тканевых компонентов. 
В настоящее время имеется ряд антител, которые окрашивают основные структурные белки базальных мембран и соединительной ткани, эндотелий сосудов. Данные антитела используются в разнообразных ситуациях. Так, окрашивание с антителами к компонентам базальных мембран коллагеном IV типа или ламинином, позволяет более достоверно диагностировать начальные признаки инвазивного роста. Эти же антитела позволяют оценить соотношение стромы и опухолевых клеток. Антитела к фактору VIII окрашивают эндотелий сосудов и могут быть использованы для оценки степени васкуляризации и сосудистой инвазии в опухолях. Они также окрашивают все сосудистые опухоли. По экспрессии CD21 на фолликулярных дендритических клетках можно судить о типе роста лимфом- диффузном или фолликулярном.  
 
5. Иммунофенотипирование опухолей, особенно опухолей  
лимфоидной системы. Иммунофенотипирование опухолей обычно бывает логически связанным с выявлением ее гистогенеза. Наиболее распространено иммунофенотипи-рование лимфом, при этом иммунофенотип лимфопролиферативных заболеваний обычно бывает выражен как перечень антигенов по классификации CD, которые обнаружены в конкретном случае. В настоящее время описано более 100 классов CD, однако для целей диагностики достаточно использовать панель, включающую по 2-3 антитела каждой специфичности. Возможен вариант панели антител представлен на рисунке 2.4-3. Для диагностики гистиоцитоза из клеток Лангерганса необходимо прибавить S-100 и СD1а. Иммунофенотипический дифференциальный диагноз 2 близких по морфологии вариантов лимфом: лимфогранулематоза и анапластической крупноклеточной лимфомы представлен в таблице 2.4-2. Если фенотипирование лимфом стало уже рутинной процедурой, то типирование лейкозов в срезах сопряжено с гораздо большими трудностями, т.к. для обычно требует применения гораздо большего числа антител, в то время как реактивность антигенов большей частью утрачена. Поэтому результативность метода не всегда удовлетворительна. Панель для фенотипирования лейкозов может состоять из CD34, антител к миелопероксидазе, KP-1 (CD68), CD15- для миелоидной линии, гликофорину А - для диагностики М6, фактору VIII или гликопротеину IIa/IIIb - для диагностики М7. Для типирования лимфобластных лейкозов пригодна "лимфомная" панель.  
 
В настоящее время особое внимание уделяется выявлению прогностических факторов, многие из которых могут быть выявлены иммуногистохимически. Так, в раках молочной железы изучают уровень экспрессии рецепторов к эстрогену и прогестерону. Для большинства опухолей очень важным прогностическим признаком служит пролиферативная активность, которую можно изучать используя антитела к компонентам, вовлеченным в процесс репликации. Иммуногистохимически можно выявлять экспрессию онкопротеинов, рецепторов факторов роста, белков- индикаторов апоптоза и т.д. Кроме того, ИГХ может быть составляющей других методов, например, гибридизации in situ.  
 
Рекомендуемая литература для чтения:  
1. Chadburn A., Knowles D.M. Paraffin-resistant antigens detectable by antibodies L26 and polyclonal CD3 predict the B- or T-cell lineage of 95% of diffuse aggressive non-Hodgkin's lymphomas. Am J Clin Path 1994; 102:284-91.  
2. Jones T.J., Coad N.A.G., Muir K.R., Parkes S.E., Evans C.D., Mann J.R. Immunophenotypic analysis of childhood Burkitt's lymphoma in West Midlands 1957-1986. J Clin Path 1995; 48:22-5.  
3. Kurtin P.J., Roche P.C. Immunoperoxidase staining of non-Hodgkin's lymphomas for T-cell lineage associated antigens in paraffin sections. Comparison of the performance characteristics of four commercially available antibody preparations Am J Surg Path 1993;17;898-904.  
4. Perkins S.L., Kjeldberg C.R. immunophenotyping of lymphomas and leukemias in paraffin-embedded tissues. Am J Clin Path 1993;99;362-73.  
 
2.5. ЦИТОГЕНЕТИКА  
 
Изменения хромосом у больных лейкозами. 
Современная цитогенетика берет свое начало с 1956 года, когда Tjio и Levan установили истинное диплоидное число хромосом в клетках человека, равное 46, и описали основные морфологические характеристики хромосом. Однако ещё раньше, в начале ХХ века проводились исследования, авторы которых пытались не только определить число и форму хромосом, но и установить их роль в процессах опухолевого роста. Первый труд, обобщающий работы в этой области, был опубликован в 1914 году Boveri. Согласно его представлениям, злокачественно перерожденные клетки характеризуются аномалиями в структуре хроматина. Позднее, после публикации работ Tjio и Levan было проведено большое число исследований, посвященных изучению хромосом в опухолевых клетках.  
 
В 1960 году был описан первый генетический маркер опухоли - филадельфийская хромосома (Ph). Она была обнаружена исследователями, работавшими в Филадельфии, Novell и Hungerford, в метафазных пластинках, полученных при культивировании клеток крови пациентов с хроническим миелолейкозом. Измененная хромосома представляла собой результат делеции примерно половины длинного плеча хромосомы 22 пары.  
 
С тех пор значительно изменились методики приготовления препаратов хромосом, качество получаемых метафазных пластинок и техническая оснащенность цитогенетической лаборатории. Все это привело к значительному прогрессу наших знаний об изменениях хромосом у больных лейкозами и опухолями и о клиническом и прогностическом значении этих повреждений.  
 
Среди большого разнообразия хромосомных аномалий выделяют специфические или первичные изменения кариотипа, которые характерны для определенных вариантов лейкозов и опухолей и, несомненно, имеют отношение к патогенезу данного заболевания. К первичным изменениям хромосом относят структурные поломки (транслокации, делеции, инверсии и амплификации), в которые вовлекаются онкогены, гены ростовых факторов, клеточных рецепторов и другие биологические активные гены. Перенос, активация или потеря генов, контролирующих работу онкогенов в составе нормального генома, а также образование вследствие транслокаций новых генетических последовательностей ДНК играют ключевую роль в процессах неопластической трансформации.  
 
Кроме специфических изменений хромосом выделяют ещё неспецифические или вторичные хромосомные аберрации, которые могут появляться в результате опухолевой прогрессии и отражают процессы клоновой эволюции лейкозных клеток. Вторичные изменения хромосом не являются уникальными. Одни и те же поломки описаны при различных опухолях. Однако выявление их в кариотипе больных отражается, как правило, на течении заболевания.  
 
Хронический миелолейкоз (взрослый тип). 
Филадельфийская хромосома (Ph) обнаруживается более, чем у 90% больных хроническим миелолейкозом (ХМЛ) как взрослых, так и детей. Образуется она вследствие реципрокной, или сбалансированной, транслокации между хромосомами 9 и 22 пар - t(9;22)(q34;q11). При этом хромосома 9 пары повреждается в локусе q34, где локализован онкоген ABL, а 22 хромосома - в точке q11, где находится ген BCR (breakpoint cluster region). В результате транслокации на 22 хромосоме образуется новая патологическая последовательность ДНК, ген BCR-ABL, белковый продукт которого характеризуется повышенной тирозинкиназной активностью, как большинство известных онкопротеинов. Интересно, что в тех случаях, когда у больных ХМЛ обнаруживаются нетипичные хромосомные изменения или нормальный кариотип, BCR-ABL ген выявляется в клетках костного мозга и периферической крови пациентов. 
Во время бластного криза у большинства больных Ph-позитивным ХМЛ выявляются дополнительные поломки хромосом. Наиболее частыми среди них являются - дополнительная филадельфийская хромосома (Ph), образование изохромосомы по длинному плечу хромосомы 17 пары (iso 17q), прибавки хромосом (трисомии) 8, 9, 19 пар, потеря одной из половых хромосом и другие более редкие дополнительные цитогенетические изменения. При благоприятном течении бластного криза и достижении больным хронической фазы обнаруживаются клетки только с Ph-хромосомой и не выявляются метафазы, несущие дополнительные хромосомные аберрации.  
 
Острый нелимфобластный лейкоз. 
В настоящее время изменения хромосом обнаруживают у большей части больных острым нелимфобластным лейкозом (ОнеЛЛ). Последние сообщения позволяют говорить, что, используя высокоразрешающую технику исследования кариотипа, патологию хромосом можно выявить у 70 - 90% больных ОнеЛЛ.  
Для каждого варианта ОнеЛЛ по Франко-Американо-Британской классификации (FAB) с разной степенью специфичности характерны определенные первичные изменения хромосом (Рис.2.5-1).  
 
Одним из наиболее частых изменений является транслокация t(8;21)(q22;q22). Она выявляется в 20% всех ОнеЛЛ и считается наиболее характерной для М2 варианта лейкоза, хотя описана и у пациентов с М1 и М4 вариантами ОнеЛЛ. Встречаемость данной патологии кариотипа у детей с М2 вариантом ОнеЛЛ составляет, в среднем, 40%. Особенности лейкозов, протекающих с t(8;21)(q22;q22), помимо частичного созревания гранулоцитарных элементов, заключаются в следующем: в лейкозных клетках обнаруживаются тельца Ауэра, вакуолизация цитоплазмы, гиперсегментация ядра, низкий уровень щелочной фосфатазы. Больные, в клетках которых обнаружена t(8;21)(q22;q22), как правило, хорошо реагируют на проводимую химиотерапию и достигают ремиссии с большей частотой, чем больные тем же вариантом лейкоза с другими цитогенетическими изменениями хромосом или с нормальным кариотипом. В частности, по данным французского кооперативного исследования (1990 год) частота достижения ремиссии у детей с транслокацией t(8;21)(q22;q22) составила 90,7%. Однако дальнейший прогноз у пациентов этой группы не столь благоприятен. Средняя продолжительность ремиссии и общая выживаемость у них, в среднем, короче, чем те же показатели у больных с другими изменениями хромосом или с нормальным кариотипом.  
 
При молекулярном исследовании клеток с транслокацией t(8;21)(q22;q22) обнаружено, что на 8 хромосоме в точке поломки локализован ген ETO, а на 22 хромосоме - AML1 ген. Вследствие транслокации происходит обмен генетической информацией, слияние двух последовательностей ДНК и образование нового гена - AML1/ETO на делетированной 8 хромосоме. Типирование данного гена методами молекулярной генетики позволяет выявлять данную последовательность ДНК в тех ситуациях, когда цитогенетический анализ провести невозможно. Кроме того, чувствительность методов молекулярной генетики значительно выше, чем стандартного цитогенетического исследования, поэтому выявление транскриптов "химерных" генов значительно улучшает диагностику данных заболеваний.  
 
Другой хорошо известный хромосомный маркер нелимфобластного лейкоза - транслокация t(15;17)(q24;q21). Она является высоко специфичной для М3 варианта ОнеЛЛ. На 17 хромосоме, в точке поломки при данной транслокации обнаружен ген рецептора ретиноевой кислоты (RARa). В результате транслокации он соединяется с геном PML1, который в норме расположен на хромосоме 15 пары. Образование данной патологической последовательности ДНК, нового "химерного" гена PML1\RARa является, несомненно, важным патогенетическим моментов в формировании острого промиелоцитарного лейкоза.  
 
Для больных М4 вариантом ОнеЛЛ типичным является повреждения 16 хромосомы - делеция del(16q), перицентрическая инверсия inv(16)(q13;q22) или транслокация между двумя хромосомами 16 пары t(16;16)(q13;q22). Точка поломки 16 хромосомы совпадает с локусом локализации гена b-частицы транскрипционно-активного CBF-фактора (Core Binding Factor). Больные с такой цитогенетической поломкой характеризуются наиболее благоприятным прогнозом.  
 
У пациентов с М5 вариантом ОнеЛЛ достаточно часто в клетках костного мозга или крови обнаруживается повреждение длинного плеча хромосомы 11 пары, чаще - транслокация t(9;11)(p21;q23) или делеция del(11)(q23). Для пациентов с такой патологией кариотипа характерны следующие клинические особенности: молодой возраст пациентов, высокий лейкоцитоз в периферической крови и неблагоприятный прогноз. По данным молекулярных исследований в результате подобных цитогенетических перестроек происходит повреждение гена MLL (ALL1), локализованного на длинном плече 11 хромосомы (11q23).  
 
У больных с эритролейкемией не обнаружены какие-либо строго специфические изменения кариотипа. Среди наиболее часто встречающихся описывают следующие: делеции хромосом 5, 7, 12 пар, трисомии по 8 хромосоме. Изменения, затрагивающие хромосомы 5 или 7 пар (-5/5q-;-7/7q-) встречаются у больных разными вариантами лейкозов. Характерной особенностью данной цитогенетической патологии является то, что она часто выявляется у больных с вторичными лейкозами, индуцированными воздействиями ионизирующей радиации, алкилирующих агентов и других потенциальных мутагенов (Рис.2.5-2). У пациентов с потерей части или целой хромосом 5 или 7 пар отмечены общие клинические особенности, а именно, резистентность или непродолжительный ответ на проводимую химиотерапию, крайне неблагоприятный прогноз. Как правило, больные умирают на ранних стадиях развития заболевания от тяжелых инфекционных или геморрагических осложнений.  
 
В результате молекулярно-генетических исследований обнаружено, что в длинном плече 5 хромосомы локализованы гены интерлейкинов 3, 4, 5, и 6, ген колониестимулирующего фактора для гранулоцитов и макрофагов, ген ростового фактора эпителиальных клеток и ряд других генов. В длинном плече 7 хромосомы находятся гены множественной лекарственной устойчивости 1 и 3 (mdr-1, -3), ген эритропоэтина, МЕТ-онкоген, ген b-цепи Т- клеточного рецептора. Потеря данных генетических последовательностей вследствие делеции 5 или 7 хромосомы или перенос их в другие участки генома в результате транслокации являются, несомненно, важными патогенетическими моментами в развитии заболевания.  
 
Острый лимфобластный лейкоз (ОЛЛ). 
Одним из наиболее частых и хорошо изученных изменений кариотипа у детей с ОЛЛ является гипердиплоидия. Причем, больные с разной степенью гипердиплоидии хромосом в лейкозном клоне характеризуются разными клиническими и прогностическими особенностями течения заболевания. Так гипердиплоидия более 50 хромосом в митозе более характерна для маленьких детей до 1 года с ни-Т, ни-В иммунологическим вариантом ОЛЛ и с низким уровнем содержания лейкоцитов в периферической крови. А незначительное повышения содержания хромосом в митозах (до 49) чаще обнаруживается у взрослых пациентов с выраженным лейкоцитозом. Больные с гипердиплоидией отличаются очень благоприятным прогнозом, причем, прогноз лучше у детей с выраженной гипердиплоидией более 50.  
 
Другим хорошо известным генетическим маркером у больных ОЛЛ является филадельфийская хромосома (Ph), которая выявляется у 5 - 10 % детей с ОЛЛ. Ph-хромосома у больных ОЛЛ, как и при ХМЛ образуется вследствие реципрокной транслокации t(9;22)(q34;q11) и цитогенетически не отличима при этих заболеваниях (Рис.2.5-3). Однако, при молекулярных исследованиях обнаружены различия в уровне поломки BCR-гена. Примерно в половине случаев Ph-позитивных ОЛЛ, как и при ХМЛ образуется BCR-ABL транскрипт длиной 8,5 kb, который кодирует белок р-210. Другой вариант поломки (примерно у 50% больных Ph-позитивных ОЛЛ) - внутри 1 интрона BCR-гена, при этом образуется мРНК 7,5 kb, и, соответственно, другой белок - р190. Больные с Ph-позитивным ОЛЛ отличаются неблагоприятным прогнозом, низкой частотой достижения ремиссии, описаны случаи резистентных лейкозов, протекающих с Ph-хромосомой. Частым осложнением у таких пациентов является нейролейкемия.  
 
Другая цитогенетическая патология, которая обнаружена у больных ОЛЛ - транслокация t(4;11)(q21;q23) Она встречается, примерно, в 2% детских ОЛЛ. Данная патология кариотипа описана у детей с врожденными лейкозами (встречаемость транслокации t(4;11)(q21;q23) у детей с ОЛЛ в возрасте до 1 года составляет 50%). Для больных с такой патологией кариотипа характерны гиперлейкоцитоз в периферической крови, гепатоспленомегалия, нейролейкемия и неблагоприятный прогноз. Иммунологический вариант лейкоза у пациентов с транслокацией t(4;11)(q21;q23), как правило, недифференцированный. Интересной особенностью данного цитогенетического варианта лейкоза является появление моноцитоидных черт в лейкозных бластах. В результате транслокации t(4;11)(q21;q23) образуется маркерный ген MLL/AF4 на 11 хромосоме.  
 
У детей с пре-В иммунологическим вариантом ОЛЛ часто выявляется транслокация t(1;19), в результате которой образуется ген E2A-PBX1.  
 
Для больных В-иммунологическим вариантом ОЛЛ характерны изменения кариотипа, затрагивающие хромосому 8 пары, где локализован c-myc онкоген, и области локализации генов тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов - 2р12, 14q32, 22q11. В результате транслокаций t(2;8)(p12;q24), t(8;14)(q24;q32), t(8;22)(q24;q11) c-myc онкоген переносится и ассоциируется с активно работающими в норме генами иммуноглобулинов.  
 
Для пациентов с Т-клеточным вариантом ОЛЛ характерны изменения кариотипа, затрагивающие точки локализации генов Т клеточных рецепторов - 14q11, 7p15, 7q35. 
 
Кроме того, у больных с Т-клеточным вариантом ОЛЛ описаны делеция длинного плеча хромосомы 6 пары - del(6q), и делеция или транслокация, затрагивающая короткое плечо хромосомы 9 пары. Больных с повреждением короткого плеча хромосомы 9 отличают высокий лейкоцитоз в периферической крови, увеличение лимфоузлов и селезенки, высокая частота экстрамедуллярных осложнений и более неблагоприятный прогноз по сравнению с другими цитогенетическими группами. В области короткого плеча хромосомы 9 локализованы гены интерферона, которые утрачиваются из кариотипа в результате делеции или переносятся в другой участок генома вследствие транслокации.  
 
Солидные опухоли. 
 
Альвеолярная рабдомиосаркома. 
Специфические изменения кариотипа, характерные для данной опухоли - транслокация t(2;13)(q37;q14).  
 
Ретинобластома.  
В случаях врожденных опухолей отмечается делеция или точечная мутация (без цитогенетически видимой делеции) гена ретинобластомы (Rb), локализованного в длинном плече 13 хромосомы (13q14). Та же генетическая патология выявляется в 15-20 % случаев приобретенных опухолей, но только в клетках опухолевого клона.  
 
Остеосаркома. 
Остеосаркома это, как правило, приобретенная опухоль. Однако, описаны случаи развития остеосаркомы у детей после ретинобластомы врожденного типа или доминантно наследуемого Li-Fraumeni синдрома. В последнем случае известно характерное повреждение гена p53, локализованного на коротком плече 17 хромосомы.  
 
Опухоль Вилмса. 
Ген опухоли Вилмса (wt) клонирован на коротком плече хромосомы 11 пары (11р13, 11р15).  
 
Гепатобластома. 
При данной опухоли описаны изменения, затрагивающие короткое плечо хромосомы 11 пары.  
 
Нейробластома.  
Наиболее частым изменением хромосом у больных с данной опухолью является делеция короткого плеча хромосомы 1 пары -del(1p). Среди других изменений, характерных для нейробластомы, часто описывают двойные микро сегменты (DMS) хромосом, которые, как известно, являются следствием амплификации генов. В клетках нейробластомы, содержащих DMS, обнаружено многократное повторение копий (амплификация) онкогена N-myc, это несомненно является следствием прогрессии опухоли.  
 
2.6. МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ 
 
Недавние достижения молекулярной биологии существенно видоизменили не только теоретическую, но и практическую онкологию. В особой степени это утверждение справедливо для детских опухолей.  
 
В настоящем разделе мы попытаемся кратко остановиться на некоторых базовых аспектах молекулярного патогенеза неоплазм, ознакомить читателей с принципами основных медико-генетических методов, а также уделить внимание конкретным лабораторным процедурам, применяемым в клинике педиатрической онкологии.  
 
Современные представления связывают возникновение малигнизаций с накоплением мутаций в генах, участвующих в регуляции пролиферации, дифференцировки и программируемой гибели клеток. Если представить картину в чрезвычайно упрощённом варианте, то "раковые" гены можно условно разделить на онкогены и супрессорные гены. Онкогены в норме, как правило,оказывают позитивное воздействие на клеточное деление, замедляют апоптоз и т.д. Их активация, проявляемая в амплификациях, мутациях регуляторных доменов или суперэкспрессии, может при определённых условиях послужить ступенькой к трансформации. Супрессорные гены оказывают противоположное влияние на упомянутые биологические процессы. К злокачественному перерождению приводит их инактивация, достигаемая за счёт делеций, критических мутаций или понижения экспрессии. Существенно, что единичного генетического повреждения для образования опухоли недостаточно - в патогенезе каждой неоплазмы участвуют не менее 5-6 независимых геномных событий. 
 
Принципы основных лабораторных молекулярно-биологических методик.  
 
Выявление подобных нарушений представляется важным не только для научных исследований, но и для повседневной медицинской практики - на детекции мутаций или уровня экспрессии генов основаны многие современные лабораторные тесты. К сожалению, молекулярно-генетические методы являются весьма сложными и трудоёмкими, поэтому далеко не все врачи понимают их принципы и возможности. Остановимся несколько подробнее на наиболее применяемых подходах.  
 
Исследованию могут подвергаться 3 основных мишени - ДНК, РНК и белок.  
 
Для исследования ДНК наиболее часто применяются цитогенетический анализ, Southern-блот и полимеразная цепная реакция (ПЦР).  
 
Цитогенетический анализ используется для выявления крупных хромосомных аномалий, затрагивающих обширные области генома. Классическое цитогенетическое исследование представляется относительно доступным методом, вследствие умеренной стоимости, относительной простоты, и, главное, достаточного количества соответствующих лабораторий и специалистов. В онкологии цитогенетический анализ может быть методом выбора для диагностики хромосомных транслокаций при гемопоэтических новообразованиях. Следует заметить, что достижения молекулярной генетики в значительной мере модернизировали и видоизменили цитогенетику: современные процедуры представляют из себя комбинацию традиционной микроскопии и молекулярно-биологических методов специфической детекции макромолекул. Хотя подобные усовершенствования на порядок повысили информативность исследований кариотипа, их применение в клинической практике остаётся ограниченным ввиду повышенной сложности.  
 
Southern-блот позволяет оценить количество копий конкретного гена в клетках (выявить амплификации и делеции), а также идентифицировать генные перестройки. Southern-блот - трудная, дорогостоящая и многоэтапная процедура. Вначале хромосомальная ДНК гидролизуется специальными ферментами и разделяется в геле при помощи электрофореза. Затем с геля делается "отпечаток" - ДНК денатурируется до одно-цепочного состояния и при помощи различных методов переносится на нейлоновый фильтр. Далее эта ДНК-содержащая мембрана инкубируется с изучаемой генетической последовательностью (в молекулярной биологии её принято называть зондом); существенно, что зонд предварительно "метится" радиоактивностью или каким-либо другим способом, и также денатурируется до одно-цепочного состояния. Если на фильтре имеются гомологичные ДНК-последовательности, то зонд гибридизуется с ними, восстанавливая двух цепочную структуру ДНК. На последнем этапе мембрана экспонируется на фотоплёнку, что позволяет визуализовать изучаемый генетический элемент. Интенсивность сигнала свидетельствует о количестве копий гена, а расположение сигналов (размер ДНК-фрагментов) говорит об отсутствии или наличии крупных генных перестроек и позволяет установить аллельную специфичность генетического элемента. Southern-блот - очень информативный метод, практически не дающий ошибочных ответов. Однако, его применение в клинике весьма ограничено - лимитирующими факторами является высокая стоимость и несовершенство "нерадиоактивных" протоколов детекции нуклеотидных последовательностей.  
 
ПЦР (polymerase chain reaction, PCR) безусловно завоевала звание "чемпиона" методик молекулярной медицины; хотя с момента её разработки прошло всего чуть более 10 лет, без неё не обходится ни одна современная онкологическая клиника. ПЦР применяется не только для уточнённой диагностики неоплазм, но и во вспомогательных целях - подборе пар донор-реципиент при трансплантациях органов и тканей, детекции сопутствующих инфекционных патологий и др. В отличие от Southern-блота, ПЦР менее пригодна для оценки макроструктуры гена, но является уникальным подходом к детальному анализу отдельных его фрагментов. Идея ПЦР заключается в специфическом синтезе in vitro коротких нуклеотидных последовательностей, необходимых для последующего изучения. Для проведения ПЦР нужны пара олигонуклеотидов (праймеров), соответствующих границам исследуемого фрагмента, и фермент ДНК-полимераза. В определенных условиях праймеры способны распознавать гомологичные последовательности в денатурированной ДНК, гибридизоваться с ними и служить затравкой для ферментативного синтеза копий участка изучаемого гена. Таким образом, каждый цикл синтеза удваивает копийность фрагмента-мишени, т.е. количество продукта (амплификата) в процессе ПЦР нарастает в геометрической прогрессии. Чувствительность ПЦР не имеет аналогов: 25-35 циклов реакции достаточно для получения "видимых" количеств амплификата из единичной клетки. После in vitro амплификации ПЦР-продукт подвергается различным методам анализа, в зависимости от цели исследования. В частности, методом ПЦР можно выявить наличие специфической генной перестройки; установить присутствие в исследуемом материале практически любого инфекционного агента; определить аллельную специфичность какого-либо локуса; детектировать увеличение числа копий изучаемого генетического элемента (этот in vivo феномен также принято называть амплификацией).  
 
Главное преимущество ПЦР - её уникальная чувствительность. Поэтому данная реакция позволяет проводить не только диагностику, но и мониторинг эффективности лечения различных патологических процессов. ПЦР относительно проста. Главное препятствие к её применению - не стоимость самой реакции, измеряемая десятками долларов, а необходимость высочайшей культуры организации и исполнения данной методики. При несоблюдении стандартов метод очень часто даёт ложно-положительные результаты. Ложноотрицательные результаты встречаются реже, хотя их появление также связано преимущественно с субъективными ошибками. Поэтому абсолютные рекомендации по применению ПЦР дать сложно - многое зависит от качества работы доступных ПЦР-лабораторий.  
 
Исследования на уровне РНК представляют из себя очень сложную задачу. Затруднения связаны с необычно высокой стойкостью внутриклеточных РНК-аз, т.е. ферментов, гидролизующих рибонуклеиновые кислоты - в частности, активные РНК-азы табака обнаруживаются... в пепле сигареты. Как следствие, даже исследовательские лаборатории зачастую избегают экспериментов, требующих получения интактной РНК. Тем не менее, в ряде клинических ситуаций анализ РНК представляется крайне необходимым. Например, работа с транскриптами требуется для эффективного выявления генных перестроек. Действительно, транскрипты не содержат интронов, поэтому размер химерного участка, необходимого для анализа, намного меньше на уровне РНК, чем на уровне ДНК. Небольшой размер позволяет выявить РНК-химеру при помощи ПЦР, тогда как детекция транслокации непосредственно на хромосоме требует применения Southern-блота или цитогенетического исследования, т.е. менее чувствительных методов. Таким образом, для изучения РНК в клинике применяют т.н. RT-PCR (reverse transcription PCR). При этом сначала на матрице РНК синтезируется её комплементарная ДНК копия (кДНК) - этот процесс требует присутствия специального фермента, обратной транскриптазы. Второй этап - анализ собственно кДНК - практически не отличается от традиционной ПЦР Другие методы исследования РНК (Northern-блот, дот-блот, гибридизация РНК in situ и т.д.) в клинических целях практически не применяются.  
 
Для исследования белка используются иммуногистохимический анализ и protein truncation test. Иммуногистохимия представляет из себя окраску белка в гистологическом препарате при помощи антител. Она позволяет оценить количество продукта гена, а также его внутриклеточную локализацию. К преимуществам данного метода следует отнести относительную простоту и чувствительность; к недостаткам - полуколичественный характер и высокий риск получения неспецифических результатов. Protein truncation test появился совсем недавно. Его идея заключается в определении размера белка, транслируемого in vitro с изолированной от пациента копии какого-либо гена. Если в гене содержится микромутация, приводящая к образованию стоп-кодона, этот метод оказывается намного проще, чем традиционное секвенирование (определение нуклеотидной последовательности фрагмента ДНК). Поиски микромутаций наиболее оправданы при диагностике наследственных раковых синдромов.  
 
Молекулярно-биологические методы в 
детской онкологической клинике 
 
Нейробластома.  
Нейробластома является не только самой частой экстракраниальной солидной опухолью у детей, но и первым примером внедрения молекулярной онкологии в клиническую практику. Ещё в середине 80-х гг. было установлено, что присутствие экстракопий онкогена N-MYC, приводящее к накоплению его продукта в клетках неоплазмы, свидетельствует о плохом прогнозе заболевания. На основании тестов, свидетельствующих об активации гена N-MYC, многие врачи рискуют назначать более агрессивную цитостатическую терапию, чем требуется по результатам традиционного клинического исследования. Повреждения гена N-MYC можно выявить и на уровне ДНК (Southern-блот или ПЦР), и на уровне белка (иммуногистохимия)  
 
Наследственные опухоли у детей. 
Причиной семейных раковых синдромов является наследование специфической мутации, чаще всего в супрессорным гене. Присутствие одного из критических генетических повреждений во всех клетках организма снижает на 1 единицу количество соматических мутаций, необходимое для формирования опухоли. За счёт этого резко увеличивается вероятность возникновения новообразований, поэтому многие из них появляются уже в детском возрасте. Классические примеры детских наследственных опухолей - ретинобластома и опухоль Вилмса.  
 
Ретинобластома - поражение сетчатки. Данная опухоль может возникнуть лишь в возрасте до 5 лет, так как позднее клетки ретины подвергаются терминальной дифференцировке и перестают делиться. Основной причиной развития ретинобластомы является повреждение гена RB-1, расположенного на длинном плече хромосомы 13. Опухоль Вилмса, также как и ретинобластома, зачастую характеризуется билатеральностью процесса. Соответствующий ген, WT-1, локализуется на коротком плече хромосомы 11.  
 
Детекция зародышевых мутаций в генах семейных опухолей у детей наиболее желательна в случаях монолатерального поражения. Если специфическое генетическое повреждение обнаружено, то риск развития неоплазмы на противоположной стороне составляет до 50-80%; более того, подобные пациенты имеют повышенную вероятность заболеть новообразованиями других органов. Поэтому, положительный ответ лабораторного теста свидетельствует о чрезвычайной необходимости ограничить контакт с канцерогенами, а также производить регулярные и прицельные клинические обследования на предмет ранней диагностики онкопатологии.  
 
Другим аспектом лабораторной диагностики при подозрении на наследственный рак у детей является обязательное обследование генома родителей. Если мутация соответствующего гена обнаружена у матери или отца больного ребёнка, то шанс унаследования повреждённого аллеля его братьями и сёстрами составляет 50%; по-видимому, в данной ситуации оправдана пренатальная диагностика, сопровождающаяся решительными мерами в случае обнаружения мутации у плода;  
 
Зародышевые мутации при семейных новообразованиях у детей зачастую настолько велики, что могут быть выявлены цитогенетиком. В случае отрицательного результата исследования кариотипа целесообразно попробовать анализ соответствующей области генома при помощи Southern-блота. Иногда причина инактивации антионкогена - микромутация, приводящая к образованию стоп-кодона внутри гена. Подобное событие можно выявить либо при помощи ПЦР, сопровождающейся секвенированием, либо посредством protein truncation test.  
 
Опухоли гемопоэтического происхождения характеризуются на молекулярно-генетическом уровне присутствием специфических транслокаций. Выявление подобных перестроек имеет существенное значение, так как позволяет производить дифференциальную диагностику данной группы заболеваний и планировать адекватное лечение. Если транслокация обнаружена, то она является оптимальным маркером для мониторинга злокачественного клона в процессе лечения и раннего прогнозирования рецидива. Для детекции таких аномалий зачастую достаточно кариотипирования; ПЦР также является методом выбора, так как позволяет выявить те перестройки, которые не обнаруживаются цитогенетическим исследованием. Однако, на этапе мониторинга пациента, особенно в стадии ремиссии, удовлетворительную чувствительность даёт лишь ПЦР.  
 
Роль молекулярно-генетических методов наиболее наглядно выражена в том случае, если врачи решились на лечение при помощи пересадки костного мозга. В подобной ситуации участие молекулярной медицины не ограничивается характеризацией трансформированных клеток, но и распространяется на другие важные мероприятия. В частности, генетики осуществляют подбор оптимального донора. Этот процесс включает в себя определение HLA генотипа. Антигены HLA I класса чаще типируются иммунологами при помощи аллель-специфических антител; однако, эффективное типирование HLA антигенов II класса требует привлечения молекулярных биологов, использующих Southern-блот или ПЦР. На пост-трансплантационном этапе, помимо мониторинга злокачественного и трансплантированного клонов, ПЦР лаборатория осуществляет диагностику оппортунистических инфекций - прежде всего, цитомегаловирусной патологии.  
 
В заключение следует отметить ещё одно достижение молекулярной онкогематологии, а именно открытие причин феномена множественной лекарственной устойчивости. Последний связан с амплификацией и/или повышенной экспрессией генов MDR-1 или Pgp. В процессе цитостатической терапии может происходить быстрая селекция злокачественных клеток, получивших вследствие соматической мутации подобные свойства, и тогда химиопрепарат неожиданно теряет свой эффект. Идентификация таких нарушений посредством Southern-блота, количественной ПЦР или иммуногистохимического анализа позволяет своевременно модифицировать терапевтический протокол за счёт включения специальных лекарств-сенсибилизаторов.  
 
Как видно из вышеизложенного, долгожданный переход молекулярной онкологии из чисто теоретической науки в фундаментально-прикладную дисциплину уже произошёл, причём клиника детской онкопатологии оказалась в лидерах испытаний непривычных генетических методов. Перечисленные выше новшества пока затрагивают лишь самые оснащённые стационары. По-видимому, в ближайшее десятилетие произойдёт не только расширение спектра применяемых тестов, но и повышение их доступности.  
 
Рекомендуемая литература для чтения:  
1. Имянитов Е.Н., Князев П.Г. Роль антионкогенов в опухолевом процессе. Эксперим. онкол., 1992, © 5, с. 3 - 17.  
2. Имянитов Е.Н., Комочков И.В., Лыщев А.А., Того А.В. Молекулярная и клиническая онкология: точки соприкосновения. Эксперим. онкол., 1993, © 5, с. 3 - 8.  
3. Имянитов Е.Н., Калиновский В.П., Князев П.Г. и др. Молекулярная генетика опухолей человека. Вопр. онкол., 1997, т. 43, © 1, с. 95 - 101.  
4. Мошкалов А.В., Имянитов Е.Н., Лыщёв А.А. и др. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) в клинике кожных и венерических болезней. Журн. дерматовенерол. и косметол., 1996, © 1, с. 88 - 94.  
5. Поллак Дж., Ван Норден С. Введение в иммуноцитохимию: современные методы и проблемы. М., "Мир", 1987.  
6. Berman E. Recent advances in the treatment of acute leukemia. Curr. Opin. Hematol., 1997, v. 4, p. 256 - 260.  
7. Caldas C., Ponder B.A.J. Cancer genes and molecular oncology in the clinic. Lancet, 1997, v. 349 (Suppl. II), р. 16 - 18.  
8. Grundy P., Coppes M. An overview of the clinical and molecular genetics of Wilms' tumor. Med. Pediatr. Oncol., 1996, v. 27, p. 394 - 397.  
9. Knudson A.G. Jr. Hereditary cancers disclose a class of cancer genes. Cancer, 1989, v. 63, p. 1888 - 1891.  
10. Lebovitz R.M., Albrecht S. Molecular biology in the diagnosis and prognosis of solid and lymphoid tumors. Cancer Investig., 1992, v. 10., p. 399 - 416.  
11. Ling V. Multidrug resistance: molecular mechanisms and clinical relevance. Cancer Chemother. Pharmacol., 1997, v. 40 (Suppl), p. S3-S8.  
12. Little M., Wells C. A clinical overview of WT1 gene mutations. Hum. Mutat., 1997, v. 9, p. 209 - 225.  
13. McKenzie S.J. Diagnostic utility of oncogenes and their products in human cancer. Biochim. Biophys. Acta., 1991., v. 1072, p. 193 - 214.  
14. McPherson M.J., Quirke P. and Taylor G.R. (eds.) PCR. A Practical approach. IRL press, 1992.  
15. Ponder B.A.J. Familial cancer: opportunities for clinical practice and research. Eur. J. Surg. Oncol., 1997, v. 13, p. 463 - 473.  
16. Ramani P., Shipley J. Recent advances in the diagnosis, prognosis and classification of childhood solid tumours. Br. Med. Bull., 1996, v. 52, p. 724 - 741.  
17. Rodriguez E., Sreekantaiah C., Chaganti R.S.K. Genetic changes in epithelial solid neoplasia. Cancer Res., 1994, v. 54, p. 3398 - 3406.  
18. Roest P.A., Roberts R.G., Sugino S. et al. Protein truncation test (PTT) for rapid detection of translation-terminating mutations. Hum. Mol. Genet., 1993, v. 2, p. 1719 - 1721.  
19. Rothberg P.G., Gamis A.S., and Baker D. Use of DNA polymorphisms to monitor engraftment after allogeneic bone marrow transplantation. Clin. Lab. Med., 1997, v. 17, p. 109 - 118.  
20. Rubnitz J.E., Crist W.M. Molecular genetics of childhood cancer: implications for pathogenesis, diagnosis, and treatment. Paediatrics, 1997, v. 100, p. 101 - 108.  
21. Rubnitz J.E., Pui C.H. Recent advances in the biology and treatment of childhood acute lymphoblastic leukemia. Curr. Opin. Hematol., 1997, v. 4, p.:233 - 241.  
22. Quesnel S., Malkin D. Genetic predisposition to cancer and familial cancer syndromes. Pediatr. Clin. North. Am., 1997, v. 44, p. 791 - 808.  
23. Sambrook J., Fritsch E.F. and Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.  
24. Schwab M., Corvi R. and Amler L.C. N-MYC oncogene amplification: a consequence of genomic instability in human neuroblastoma. Neuroscientist, 1995, v.1, p. 277 - 285.  
25. Yandell D.W., Poremba C. Genetics of retinoblastoma: implications for other human cancers. Med. Pediatr. Oncol. (Suppl), 1996, v. 1, p. 25 - 28  
 
2.7. Информация о диагнозе для больных детей и их родителей.  
 
Родители. 
Когда диагноз злокачественного заболевания установлен, нужно информировать об этом родителей ребенка. Это необходимая, но очень нелегкая задача. Способ, которым родителям сообщается об опасном для жизни заболевании их ребенка, может воздействовать на них таким образом, что вызовет дополнительный и ненужный стресс. Нужно понимать, что заболевание ребенка обязательно коснется всех членов семьи.  
 
Родители очень отчетливо помнят ситуацию, в которой им сообщили о жизненно-опасном заболевании их ребенка. Поэтому беседа с родителями должна быть планируемым событием, когда родители будут готовы к получению информации. Беседа должна происходить в отдельной комнате, без посторонних и без отвлечений на другие предметы. Беседовать лучше с обоими родителями одновременно, чтобы они оба получили одинаковую информацию непосредственно от врача, а не в пересказе, нередко извращенном. Важно, чтобы с этой первой беседы возникли доверительные отношения с врачом, которые помогут в дальнейшем длительном лечении ребенка. Беседа дожна быть максимально откровенной, особенно при обсуждении вариантов прогноза. Предлагаемая информация должна быть честной, и содержать положительную поддержку, но без нереальных обещаний. Родители должны понять серьезность ситуации, получить информацию о предполагаемом лечении, в том числе о возможных серьезных осложнениях. Последующие беседы с родителями лучше проводить по их письменным конкретным вопросам.  
 
Индивидуальное восприятие диагноза "рак" зависит от возраста, общего развития, образования, культуры, эканомического положения. Конкретная семья - это всегда особая ситуация и первая беседа такого рода должна планироваться и проводиться строго индивидуально.  
 
Чаще всего первая реакция родителей на диагноз злокачественной опухоли у их ребенка - сильные эмоции: шок, страх, неверие, гнев, чувство вины, депрессия или апатия. Родители понимают, что в семью неожиданно пришло горе. Чувство неверия, возникающее у родетелей, - это нормальная реакция на столь неожиданное событие. Население в широком смысле практически ничего не знает о детских опухолях и об их курабельности. В нашей стране диагноз "рак" часто приравнивают к смертному приговору.  
 
Родители часто спрашивают себя и окружающих " не виноваты ли мы?, не могли ли мы это предотвратить?", "что мы делали не так или чего мы не делали?, ведь рак не мог возникнуть без причины!". Родители могут винить себя или друг-друга в каких-то оплошностях. Их нужно успокоить и обьяснить, что причина опухоли - не в них.  
 
Следующая типичная стадия реакции родителей на болезнь - так называемое "отрезвление", когда родители активно пытаются получить максимально подробную информацию о заболевании, о состоянии ребенка, о существующих методах лечения. К сожалению, на этом этапе нередки метания родителей в сторону "нетрадиционной медицины", представители которой не скупятся на радужные обещания, на что уходит драгоценное время, и, если не удается убедить родителей в необходимости немедленного "традиционного" лечения, ребенок может погибнуть от прогрессирования заболевания. К счастью, таких примеров немного, но этот момент надо учитывать при беседах с родителями. Позднее, когда родители узнают все больше и больше о болезни, о методах её лечения, чем глубже они погружаются в необходимый уход, жизнь семьи постепенно возвращается в нормальное русло, семья адаптируется к случившемуся, и родители должны стать союзниками медперсонала отделения, где лечится ребенок, в совместной борьбе с болезнью.  
 
Ребёнок. 
Детское воспрятие любой болезни определяется возрастом, уровнем развития и предшествующим опытом общения с медиками. Малыши не знают ничего о злокачественных опухолях, не имеют этой психологической нагрузки, однако условия стационара, необходимые болезненные процедуры, необычные, порой пугающие, условия ряда обледований могут вызвать стресс, который выражается в "обратном развитии": ребенок может отказываться от отработанных привычек -проситься в туалет, отказываться говорить, отказываться от привычных игр. Иногда это настолько сильное эмоциональное потрясение, что ребенок может постоянно находиться в состоянии возбуждения и раздражения.  
 
Старшему ребенку следует изложить максимально доступно информацию о заболевании, о необходимости лечения и о том, в каком виде это будет происходить. Эти сведения каждому ребенку должны быть поданы на языке, соответствующем его уровню развития. В нашей стране до сих пор часто стремятся скрывать диагноз злокачественной опухоли от больного, но в действительности, невозможно полностью скрыть характер заболевания от ребенка. Вся обстановка специализированного отделения будет указывать на неординарность болезни. Отсутствие правдивой информации может принести гораздо больший вред впечатлительному ребенку, который может представить, что его болезнь вообще неизлечима. Он сравнивает собственные ощущения с симптомами соседа по палате, ловит обрывки фраз и ставит себе диагнозы, как правило, неверные. Врачам хорошо известно, что старшие дети и, особенно, подростки хорошо информированы о своем заболевании и они прекрасно чувствуют ложь в словах взрослых, что подрывает их доверие к ним и, в конечном итоге, отрицательно скажется на процессе лечения.  
 
Общение взрослых (медперсонала и родственников) с ребенком на тему его болезни должны быть достаточно оптимистичны и обнадеживающи, чтобы ребенок смог подавить свой страх и чувствовать опору и заботу со стороны взрослых. В самом деле, дети чаще легче родителей адаптируются к "плохому" диагнозу, поскольку у них ещё отсутствуют мощные предубеждения по отношению к диагнозу и курабельности опухоли. Постоянно поддерживаемый положительный эмоциональный фон - столь же необходимый компонент лечения, как и все остальное.  
 
К сожалению, в штатном расписании онкологических отделений нашей страны не предусмотрены психологи и социальные работники (как эта специальность называется в клиниках европейских стран), которые профессионально могут и должны помогать ребенку и его родителям в трудных ситуациях, возникающих в процессе лечения. Поэтому вся психологическая нагрузка по контактам с родственниками больного целиком ложится на лечащего врача. От его такта и умения общения с семьей больного ребенка в критической ситуации во многом зависит степень контакта и доверия членов семьи ко всему процессу лечения

В лечении детей с онкологической патологией используются все три известных метода лечения опухолей. Исторически первым методом лечения опухоли был хирургический. Если удавалось радикально удалить солидную опухоль до возникновения метастазов, это спасало больным жизнь. В 50-е годы появилась возможность использовать рентгеновские лучи с лечебной целью, позже в практику радиологов вошли аппараты высокой энергии с большой проникающей способностью излучения, что позволяло более эффективно использовать лучевую терапию. Позже всех в практику онкологов вошла химиотерапия - метод высокоэффективного лечения многих опухолей у взрослых и большинства опухолей у детей. Так, например, при лечении большинства лейкемий и лимфом используется только химиотерапия, а лучевая терапия и оперативный метод используются крайне редко в эксквизитных случаях. А при лечении опухолей головного мозга - основной метод - хирургический, где главный фактор прогноза - степень радикальности операции. Хотя без адекватно проведенной лучевой терапии даже в случае тотального удаления злокачественной опухоли головного мозга трудно говорить об излечении этих больных. Без радикального удаления опухоли невозможно вылечить больного с остеогенной саркомой или с опухолью Вилмса, но нужно иметь в виду, что в лечении этих опухолей химиотерапии принадлежит второе по значимости место, и что часто дает возможность произвести радикальную операцию, максимально щадящую для организма.  
 
Современное лечение злокачественных опухолей - это программное, протокольное лечение, разработанное на основе знаний особенностей биологического поведения опухолей, фармакодинамики и фармакокинетики различных препаратов, принципов комбинации различных терапевтических методов, их последовательности и последствий. Работа по усовершенствованию протоколов лечения идет непрерывно во всех экономически развитых странах, в различных кооперативных группах (SIOP - международное общество детских онкологов, BFM- Германия, Австрия, SFOP- общество детских онкологов Франции, POG - детская онкологическая группа и CCSG - кооперативная группа по изучению детского рака в США и другие) вследствие чего достигнуты столь впечатляющие результаты лечения большинства детей с онкологической патологией.  
 
3.1. ХИМИОТЕРАПИЯ (ХТ). 
 
Термин химиотерапия означает использование цитотоксических агентов, т.е. лекарств, токсичных для клеток. Химиотерапевтические средства назначаются или по одному - режим монохимиотерапии или в комбинациях - полихимиотерапия. Эти медикаменты могут использоваться как единственный метод лечения злокачественных опухолей или в сочетании с другими методами противоопухолевой терапии (хирургическим и лучевой терапией).  
 
Назначение химиотерапии требует от врача и всего медперсонала знаний по механизму действия цитостатиков, правил их хранения и применения, а также знаний о непосредственных, отсроченных и отдаленных последствий их использования. Врач обязан информировать больного и его родителей обо всех возможных осложнениях применения того или иного цитостатика.  
 
Расчет доз химиопрепаратов производится не на килограмм массы тела, как это принято в общей педиатрии, а на квадратный метр поверхности (м2), что для цитостатиков является более адекватным.  
 
Клеточный цикл. 
 
Знание нормального клеточного цикла необходимо для понимания механизма действия различных цитостатиков. Клеточный цикл состоит из 5 периодов (Рис. 3.1-1): Go- неактивная фаза отдыха клетки. Цикл начинается с периода G1 (постмитотический период), когда происходит подготовка к производству ДНК, в период S- фазы (фазы синтеза) происходит удвоение количества ДНК для того, чтобы в фазу М (митоза) образовались две дочерние клетки, идентичные родительской. G2 - премитотический период, в который происходит синтез белка и РНК.  
 
Число опухолевых клеток, находящихся в фазе Go, может быть значительным фактором для возникновения рецидива, поскольку практически все химиотерапевтические агенты действуют только на фазы "работающей" клетки. Клетки в фазе покоя нечувствительны к ХТ. Таким образом, может формироваться первичная резистентность опухоли к ХТ. Чем более интенсивно клетки "работают", т.е. делятся, тем более они будут чувствительны к ХТ, при этом абсолютно неважно, злокачественные это клетки или нормальные.  
 
Опухолевые клетки могут отклоняться от течения нормального клеточного цикла, делясь не на две дочерние клетки, а образуя большее количество дочерних клеток, либо формируя аномальные хромосомные наборы. Кроме того, опухолевые клетки не реагируют на влияние рост-ингибирующих факторов, которые регулируют пролиферацию нормальных клеток. На рисунке 3.1-2 показана нормальная эволюция покоящейся стволовой клетки от фазы покоя через активный клеточный цикл до следующей фазы покоя, во время которой могут происходить процессы созревания или дифференцировки клетки.  
 
Клетки костного мозга и ЖКТ практически непрерывно пролиферируют и поэтому подвергаются отрицательным эффектам ХТ намного больше, чем другие ткани. Токсический эффект ХТ на эти две ткани - может быть, главный лимитирующий фактор переносимости ХТ.  
 
Химиопрепараты могут быть разделены на 3 категории:  
1.Препараты, действующие на определенных фазах клеточного цикла;  
2.Препараты, действующие на все фазы клеточного цикла;  
3.Препараты, имеющие другой механизм действия (не на уровне клеточного цикла).  
 
Цель ХТ - разрушить все опухолевые клетки, поэтому обычно назначается комбинация препаратов с различным механизмом действия, работающих как на уровне клеточного цикла, так и вне его для достижения потенциально оптимального эффекта.  
 
Антиметаболиты. 
 
Эти препараты имеют сходство с естественными веществами, участвующими в репликации клеток. Их механизм действия состоит в конкуренции или блокировании естественных компонентов клеточного цикла.  
 
Метотрексат (МТХ) 
Синтез пуриновых нуклеотидов, тимидилата и аминокислот серина и метионина зависит от наличия редуцированных фолатов, или тетрагидрофолатов (FH4). Дигидрофолат редуктаза (DHFR) - фермент, ответственный за поддержание внутриклеточного FH4. Метотрексат очень сходен по структуре с фолиевой кислотой и является ингибитором DHFR. Присутствие МТХ вызывает аккумуляцию фолата в неактивной окисленной форме, что ведет к клеточной гибели. Существует ряд возможных механизмов клеточной резистентности к МТХ:  
1. Амплификация DHFR-гена приводит к увеличению уровня внутриклеточного DHFR, таким образом перекрывается действие МТХ на этот фермент;  
2. Специфичность (тропность) DHFR к МТХ может быть снижена путем малейших повреждений в структуре фермента;  
3. Нарушение транспорта МТХ в клетку.  
 
Назначение фолиевой кислоты (лейковорина) через 24-36 часов после инфузии МТХ обрывает действие МТХ и позволяет клеткам продолжать нормальное деление. Такая методика позволяет применять очень высокие дозы МТХ при условии адекватной "защиты" клеток. Уровень МТХ в сыворотке крови должен тщательно мониторироваться для того, чтобы регулировать дозу лейковорина. Высокие дозы МТХ используются при лечении ОЛЛ, НХЛ и имеют целью повысить проникновение МТХ через гематоэнцефалический барьер в ЦНС. При остеосаркоме использование высоких доз МТХ позволяет повысить концентрацию МТХ в ткани опухоли.  
 
Возможные осложнения:  
-мукозиты;  
-диарея;  
-миелосупрессия;  
-гепатотоксичность;  
-дерматиты;  
-лейкоэнцефалопатии (особенно в сочетании с облучением);  
-нефротоксичность (при высоких дозах).