Особенности морфологии и физиологии микроорганизмов рода Staphylococcus

Такие колонии, не менее двух из каждого посева, отвивают на скошенный мясопептонный агар для последующей проверки выросших культур в реакции плазмокоагуляции. Чтобы избежать ошибок в определении желточной реакции, необходимо иметь в виду, что иногда наблюдается помутнение среды без радужного ободка, в этом случае проба на лецитовителлазу считается отрицательной. Если же колонии, выросшие на ЖСА, не дают лецитовителлазной реакции, т. е. не окружены радужным венчиком, но имеется рост стафилококков, то их тоже считают подозрительными и также отвивают не менее двух из каждого такого посева на чашки с простым питательным агаром пятнами диаметром 5-10 мм. После суточного инкубирования при 37 °С полученные макроколонии проверяют в реакции плазмоагглютинации, для чего микробную массу размешивают петлей на стекле в каплях цитратной кроличьей или человеческой плазмы, разведенной 1/4. Образование хлопьев учитывают в течение 30с - 1 мин.

 

Помимо кровяного агара и ЖСА, также используют следующие среды:

Молочно-солевой  агар. В 100 см³ МПБ растворяют 6.5 г хлорида натрия, 20 г агар-агара. Устанавливают рН 7,4, стерилизуют при 121 °C 20 мин. Перед использованием агар расплавляют, охлаждают до 45 °С, добавляют 10 % стерильного обезжиренного молока и разливают по чашкам Петри. На этой среде определяют пигментообразование и способность к росту при наличии 6,5 % хлорида натрия.

Лактозо-солевой  бульон с фенолротом. В 1000 см³ дистиллированной воды растворяют 10 г триптона, 5 г мясного экстракта, 1 г дрожжевого экстракта, 5 г хлористого лития, 20 г агара. Устанавливают рН 6,8, разливают по пробиркам и стерилизуют при 121°С 15 мин. При росте коагулазоположительных стафилококков среда желтеет (тест на коагулазу положительный).

Теллурит-полимиксин-желточный агар Крисли. В 1000 см³ дистиллированной воды растворяют 10 г триптона, 5 г дрожжевого экстракта, 5 г маннита, 20 г хлорида натрия, 2 г хлористого лития, 18 г агара. Устанавливают рН 7,3, стерилизуют 15 мин при 121 °С.

Перед использованием в среду добавляют 100 см³ 30 %-ной желточной эмульсии (на физиологическом растворе), 0,4 см³ стерилизованного фильтрацией 1 %-ного водного раствора полимиксина М, 10 см³ стерилизованного автоклавированием (121 °С 15 мин) 1 %-ного водного. 
раствора теллурита натрия.

Среда Джиолиотти и Кантони. В 1000 см³ дистиллированной воды растворяют 10 г триптона, 5 г мясного экстракта, 5 г дрожжевого экстракта, 5 г хлористого лития, 20 г маннита, 5 г хлористого натрия, 1,2 г глицина, 3 г пирувата натрия. Устанавливают рН 6,9, стерилизуют при 115 °С 20 мин. Перед употреблением к среде добавляют 0,1 см³ 1 %- ного водного раствора теллурита натрия, стерилизованного фильтрацией. При росте коагулазоположительных стафилококков наблюдается почернение среды или черный осадок.

Среда Бэрда-Паркера. К 90 см³ основной среды с температурой 45 °С добавляют 6,3 см³ глицинового раствора, 1 см³ раствора теллурита натрия, 5 см³ эмульсии желтка, перемешивают и разливают в чашки Петри. Среда пригодна к использованию в течение 28 дней (хранение при 4 °С). Перед посевом на поверхность среды наносят 0,5 см³ 20 %-ного водного раствора пирувата натрия, стерилизованного фильтрацией; распределяют по поверхности, подсушивают.

Колонии коагулазоположительных стафилококков черные, блестящие, с  узкой серо-белой полосой и  окружены прозрачной зоной.

Желточная эмульсия. Свежее куриное яйцо выдерживают в 0,001 %-ном растворе HgCl₂. Соблюдая требования асептики, отделяют желток и эмульгируют его в 200 см³ физиологического раствора.

Глициновый  раствор. Глицин — 20г,дистиллированная вода - 100 см³. Стерилизуют при 120 °С 15 мин.

Раствор теллурита натрия. Теллурит натрия - 1 г, дистиллированная вода - 100 см³. Стерилизуют фильтрацией.

Среда Чагогана-Бернса. К 100 см³ МПА добавляют 3,3 см³ ОД %-ного водного раствора кристаллического фиолетового и 5 г лактозы. Устанавливают рН 6,8. Стерилизуют автоклавированием. Колонии патогенных стафилококков растут быстрее, чем непатогенных, и приобретают фиолетовый или оранжевый цвет.

Среда Чемпена (для выделения патогенных стафилококков). 
Вариант 1: пептон - 1 %, D-маннит - 1 %, натрия хлорид - 7,5 %, дрожжевой экстракт — 0,25 %, двузамещенный фосфорнокислый калий - 0,5 %, агар-агар - 1,5 %, Среду стерилизуют 90 мин при 110 °С, устанавливают рН 7,0 и добавляют 10 % стерильного обезжиренного молока (молоко способствует лучшему образованию пигмента).

Вариант 2: пептон - 1 %, дрожжевой экстракт - 0,25 %, желатин -3 %, лактоза - 0,2 %, D-маннит - 1 %, натрия хлорид- 7,5 %, двузамещенный фосфорнокислый калий — 0,5 %, агар-агар — 1,5 %. Стерилизуют 90 мин при 110 °С, устанавливают рН 7,0.

Коагулазной активностью  обладает 24-56% штаммов S.hyicus sb. hyicus, однако реакция чаще замедленная [10].

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

6 Внутриродовая и межвидовая идентификация стафилококков

 

Во внутриродовой идентификации  применяют бактериологические, микроскопические и серологические методы. Основным является бактериологический метод. Материал для исследования - кровь, гной, слизь из носа и зева, отделяемое ран, мокрота (при пневмонии), испражнения (при колите), подозрительные продукты, рвотные массы и промывные воды желудка, испражнения - при пищевых интоксикациях.

Имеются принципиальные схемы  выделения и идентификации стафилококков, в т.ч. с использованием микротест-систем.

В общем виде схема выглядит следующим образом. Проводят бактериоскопию, выявляя грамположительные кокки  в виде гроздей винограда (стафилококки). Высевают материал на простые питательные  среды. Подозрительные колонии отбируют и пересевают для изучения на дифференциальные среды - на кровяной агар (гемолиз), молочно - солевой и молочно - желточно - солевой  агары (за счет NaCl угнетается рост посторонней  микрофлоры, использование сред позволяет  лучше выявить пигмент и лецитиназу). Выделенную культуру идентифицируют по видовым признакам, определяют наличие  золотистого пигмента, плазмокоагулазную  активность, сбраживание маннита, гемолиз, чувствительность к антибиотикам, проводят фаготипирование.

Из серологических тестов чаще применяют РПГА и ИФА для  выявления антител к видоспецифическим  антигенам (тейхоевым кислотам).

Для определения энтеротоксигенности  чаще применяют биологический метод, определение энтеротоксина в  реакции преципитации в агаре, определение  РНК- азы (коррелирует с выработкой энтеротоксина).

Из видоспецифических  антигенов отдельно следует сказать  о белке А золотистого стафилококка, имеющего важное значение в патогенезе и лабораторной диагностике. Уникальным свойством белка А является его  способность связывать Fc- фрагменты  иммуноглобулинов (субклассов 1,2 и 4 IgG). Белок А, неспецифически связывая Fc- фрагмент IgG, активирует компоненты комплемента  по классическому и альтернативному  пути и усиливает активность натуральных  киллеров (клеток NK). Активация приводит к развитию различных местных  и системных реакций (анафилаксии, феномена Артюса), угнетению опсонофагоцитарных реакций.

Способность белка А взаимодействовать с любыми (не только специфическими к стафилококку) иммуноглобулинами затрудняет серологическую диагностику стафилококковых инфекций, особенно сепсиса. За счет этого механизма (наличия белка А в крови) у этих больных могут быть выявлены ложноположительные серологические тесты на другие инфекции.

Способность стафилококков  за счет белка А нагружаться иммуноглобулинами (в т.ч. специфическими антителами к  различным возбудителям) используется в реакции коагглютинации. Насаженные на стафилококки (стафилококковый реагент из инактивированных микробных клеток) специфические антитела за счет свободных активных центров при взаимодействии с соответствующим антигеном (суспензией культуры микроорганизма) дают быструю реакцию агглютинации (коагглютинации - поскольку антитела агглютинируют культуру не самостоятельно, а в комплексе со стафилококками, что и обеспечивает быстрое осаждение тяжелых - нагруженных стафилококками комплексов совместно со специфическим искомым агентом).

Белок А широко используют также в ИФА для выявления  специфических IgG- антител (конъюгаты "белок  А - пероксидаза"), стафилококковый  реагент - для дифференциации титров IgG- и IgM- антител в серологических реакциях по снижению титров IgG- антител  после обработки проб сыворотки  крови стафилококковым реагентом [7].

 

Видовая идентификация проводится по биохимическим свойствам, с использованием тест-систем. Пример: «STAPHYtest»

Набор СТАФИтест  предназначен для идентификации представителей стафилококков и родственных  микроорганизмов. Набор позволяет  провести 60 определений по 16 биохимическим  тестам с возможностью визуальной и автоматизированной оценки результатов биохимических реакций. Система для идентификации дополнена тестами для определения продукции ацетоина и выявления цитохромоксидазы, которые поставляются в виде диагностических полосок – ВПтест (Voges-Proskauer) и ОКСИтест, соответственно, ПИРАтест – для определения пирролидонилариламидазы [9].

Набор СТАФИтест содержит:

• 10 микротитровальных пластинок (каждая для идентификации 6 штаммов) с силикагелем;
• Инструкцию для пользователя с Идентификационной таблицей;
• Цветная шкала для СТАФИтест;
• 10 полиэтиленовых пакетиков для инкубации;
• Пакет для хранения частично использованной пластинки, 1 шт.;
• 60 бланков для регистрации результатов;
• Крышка;

Условия хранения, срок годности: СТАФИтест следует хранить при температуре от +2 до +8 °С. Срок годности указан на каждой упаковке.

 

Принцип работы:

1. Выделение культуры;
2. Приготовление бактериальной суспензии;
3. Подготовка стриппированных пластинок;
4. Инокуляция;
5. Инкубация;
6. Учет результата;

Контроль качества: Химический контроль качества реактивов, используемых при производстве СТАФИтест, осуществляется стандартными методами. Производственные партии пластинок контролируются с помощью контрольных референтных бактериальных культур. Для работы с пластинками СТАФИтест  в лаборатории рекомандуем использовать следующие контрольные штаммы.

Таблица 1 – Реакции контрольных  штаммов

 

Для контроля функциональности набора необходимо всегда пользоваться свежими изолятами штаммов. Данные штаммы служат для контроля функциональности набора, а не для контроля идентификации «Приложение З».

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

7 Сходство, отличия и дифференциация микроорганизмов, принадлежащих к роду Staphylococcus с близкородственными родами Micrococcus, Lactococcus, Streptococcus, Enterococcus

 

Общие признаки вышеперечисленных родов. Грамположительные, сферической или шаровидной формы кокки с диаметром 0,5 – 2 мкм. Располагаются одиночно, парами, короткими цепочками. Клетки родов Staphylococcus и Micrococcus могут располагаться в виде неправильных скоплений. Неподвижны. Факультативные анаэробы, за исключением рода

Micrococcus (аэробы). Все они растут в широком диапазоне температур (20-37 °С). Растут в присутствии хлорида натрия (NaCl) в концентрациях 5-10 %. Ферментируют углеводы с образованием кислоты. Распространены на поверхностях слизистых и кожи, в кишечнике животных и человека.

 

Таблица 2 - Дифференциация микроорганизмов.

Род	цитохромоксидаза	каталаза	Образование пигмента	Рост на питательных средах	Опт. рН	Кол-во видов
Staphylococcus		+	Белый, кремовый, желтый и  оранжевый цвет	Среды содержащие пептон, глюкозу, кровь или сыворотку	7,0 – 7,5	34
Micrococcus	+	+	Желтый или красный  цвет	Обычные среды содержащие пептон		9
Enterococcus		-	Красный и лимонно-желтый цвет	МПА или среды содержащие кровь	4,5 – 10	16
Streptococcus	+	-	Желтый и красный цвет	Среды содержащие кровь или  сыворотку	7,2 – 7,4	21
Lactococcus	-	+		Среды содержащие углеводы и белки	6,3 - 6,5	5