Представление о бактериофаге

Содержание

1. Особенности строения

2. Жизненный цикл фага

3. Взаимодействие фага с бактериальной клеткой

4. Методы культивирования бактериальных вирусов (фагов) и их индикация

5. Качественный метод определения фагов E.coli

6. Количественный метод - определение титра фага по методу Грациа

Список литературы

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Введение

Бактериофаги (фаги) (от греч. цЬгпт - пожирать) - вирусы, избирательно поражающие бактериальные клетки. Чаще всего, бактериофаги размножаются внутри бактерий и вызывают их лизис.

Бактериофагия - процесс  взаимодействия фагов с бактериями, заканчивающийся очень часто  их разрушением (от лат. bacteriophage - пожирающий бактерии).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1. Особенности строения

Как правило, бактериофаг  состоит из белковой оболочки и генетического  материала - одноцепочечной или двуцепочечной РНК. Размер частиц приблизительно от 20 до 200 нанометров. Современная классификация бактериофагов включает 13 семейств, подразделенных более чем на 140 родов, которые содержат более 5300 видов фагов. В настоящее время эти вирусы выявлены у большинства бактерий, как болезнетворных, так и неболезнетворных, а также ряда других микроорганизмов (например, грибов).

Фаги различаются по форме, структурной организации, типу нуклеиновой  кислоты и характеру взаимодействия с микробной клеткой.

Фагам присущи все биологические  особенности, которые свойственны  вирусам. Их геном представлен либо ДНК, либо РНК и заключен в белковую оболочку (капсид), структурные субъединицы которой уложены по типу либо спиральной, либо кубической симметрии. Крупные фаги, имеющие хвостик, устроены по типу бинарной симметрии (головка - икосаэдр, хвостик - спиральная симметрия). Фаги различаются по форме - нитевидные, сферические; фаги, имеющие головку и хвостик; по размерам - мелкие, среднего размера и крупные .

Большинство фагов под  электронным микроскопом имеют  форму головастика или сперматозоида, некоторые - кубическую и нитевидную формы. Размеры фагов колеблются от 20 до 800 нм у нитевидных фагов.

Наиболее полно изучены  крупные бактериофаги, имеющие форму  сперматозоида. Они состоят из вытянутой  икосаэдрической головки размером 65-100 нм и хвостового отростка длиной более 100 нм .

Внутри хвостового отростка имеется полый цилиндрический стержень, сообщающийся отверстием с головкой, снаружи - чехол, способный к сокращению наподобие мышцы. Хвостовой отросток заканчивается шестиугольной базальной пластинкой с короткими шипами, от которых отходят нитевидные структуры - фибриллы.

Существуют также фаги, имеющие длинный отросток, чехол  которого не способен сокращаться, фаги с короткими отростками, аналогами отростков, без отростка.

Фаги состоят из двух основных химических компонентов - нуклеиновой  кислоты (ДНК или РНК) и белка. У фагов, имеющих форму сперматозоида, двунитчатая ДНК плотно упакована в виде спирали внутри головки.

Белки входят в состав оболочки (капсида), окружающей нуклеиновую кислоту, и во все структурные элементы хвостового отростка. Структурные белки фага различаются по составу полипептидов и представлены в виде множества идентичных субъединиц, уложенных по спиральному или кубическому типу симметрии.

Кроме структурных белков, у некоторых фагов обнаружены внутренние (геномные) белки, связанные  с нуклеиновой кислотой, и белки - ферменты (лизоцим, АТФ - аза), участвующие  во взаимодействии фага с клеткой.

Фаги более устойчивы  к действию химических и физических факторов, чем бактерии. По степени  устойчивости к действию различных  факторов внешней среды и химических веществ фаги занимают место между  вирусами и неспоровыми бактериями. Они устойчивы в пределах рН от 5,0 до 8,0, большинство из них не инактивируется холодными водными растворами глицерина и этилового спирта. На них не действуют такие ферментные яды, как цианид, фторид, динитрофенол, а также хлороформ и фенол. Фаги хорошо сохраняются в запаянных ампулах и в лиофилизированном состоянии, но легко разрушаются при кипячении, действии кислот, химических дезинфектантов, при УФ облучении.

Высокочувствительны фаги к  формалину и кислотам. Инактивация большинства фагов наступает при температуре 65-70 °С. Длительное время они сохраняются при высушивании в запаянных ампулах, замораживании при температуре -185 °С в глицерине.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2. Жизненный цикл фага

Различают фаги инфекционные, т. е. способные вызвать разные формы фаговой инфекции, и неинфекционные (вегетативные), или незрелые фаги, находящиеся еще в стадии размножения. В свою очередь инфекционные фаги разделяют на покоящиеся (находящиеся вне клетки), вирулентные - способные вызвать продуктивную форму инфекции, и умеренные фаги - способные вызывать не только продуктивную, но и редуктивную фаговую инфекцию.

Жизненный цикл фага может  проявляться в форме:

· продуктивной (фаг размножается в клетке и выходит из нее);

· редуктивной (геном фага проникает в клетку, однако размножения фага не происходит, его геном интегрируется в хромосому клетки - хозяина, становится ее составной частью, т. е. фаг превращается в профаг, а клетка становится лизогенной);

· абортивной инфекции, при  которой взаимодействие фага с клеткой  обрывается на какой - то стадии жизненного цикла фага, и он погибает.

Клетка, несущая профаг, называется лизогенной, потому что профаг, передающийся клеткой по наследству, может выйти из хромосомы, активироваться и вызвать продуктивную форму инфекции.

Если в результате лизогении, т. е. внедрения профага в хромосому клетки - хозяина, она получает новые наследуемые признаки, такую форму ее изменчивости называют лизогенной конверсией, т. е. изменчивостью, обусловленной лизогенией. Лизогенную конверсию вызывают только умеренные фаги.

Жизненный цикл фага, сопровождающийся продуктивной инфекцией, складывается из 6 последовательных стадий, каждая из которых, в свою очередь, состоит из нескольких этапов.

1. Адсорбция фагов на  клеточной поверхности бактерий  при помощи специфических рецепторов (белков - лоцманов), которые располагаются  на кончике нити, шипа или хвостика. В свою очередь, на клеточной  стенке бактерии располагаются  ее фагоспецифические рецепторы, распознаваемые фагом. Адсорбция фага - пусковой момент его жизненного цикла. Она очень специфична и поэтому обусловливает возможность практического использования фагов, например для идентификации, бактерий, а также для лечебных и профилактических целей.

2. Проникновение фагового генома через клеточную стенку и цитоплазматическую мембрану внутрь клетки и освобождение его от оболочки (раздевание фага).

3. Установление фагового генома с помощью белка - лоцмана для реализации содержащейся в геноме информации:

а) однонитевая ДНК - к  репликативному аппарату для синтеза комплементарной ей нити и образования репликативной формы; далее ее поведение аналогично двунитевой ДНК;

б) двунитевая ДНК - к транскрипционному аппарату для синтеза мРНК и последующей трансляции вирусспецифических белков (ферментов и структурных);

в) РНК - геном - к трансляционному  аппарату для синтеза вирусоспецифических  белков (ферментов репликации и структурных).

4. Репликация фаговой геномной ДНК или РНК.

5. Сборка вновь синтезированных  вирионов - заключение геномной НК в белковую оболочку, морфогенез фагов.

6. Выход вновь синтезированных  фагов из клетки:

а) путем отпочковывания (М13 - единственный фаг, не вызывающий при выходе из клетки ее гибели);

б) путем лизиса клетки изнутри. Он осуществляется свободным лизоцимом  и вызывает гибель клетки.

Степень зависимости репликации ДНК фага от хромосомы клетки определяется набором генов у фагов. Крупные  фаги осуществляют репликацию полностью  автономно; средние - частично нуждаются  в помощи бактериальных генов, а  мелкие почти полностью зависят от хромосомных генов.

Морфогенез мелких фагов  протекает по типу самосборки. У крупных фагов этот процесс имеет более сложный характер. Например, морфогенез фага Т4 требует активности более чем 40 генов и протекает при участии трех самостоятельных линий. На одной из них происходит сборка хвостика (участвует около 20 генов), на другой - головки фага (не менее 16 генов) и на третьей - сборка ворсинок (5 генов). Соединение хвостика с головкой не требует участия генов, однако оно не может произойти до тех пор, пока и хвостик, и головка не будут смонтированы полностью. Точно так же ворсинки могут присоединяться к хвостику только после того, как он соединится с полностью готовой головкой. Благодаря строгому генетическому контролю со стороны фага обеспечивается последовательность и согласованность всех процессов его внутриклеточного размножения.

Выход сформировавшихся фагов  в большинстве случаев происходит благодаря лизису изнутри свободным  лизоцимом. Он синтезируется на самом  последнем этапе размножения  фага. Иногда бывает лизис бактерий извне как следствие адсорбции  многих фагов на одной клетке, но при этом размножения фагов не происходит. Обычно же после внедрения  фагового генома в клетку у нее возникает состояние иммунитета к суперинфекцни данным фагом, т. е. проникновение других фаговых геномов становится невозможным. Иммунитет обеспечивается особым цитоплазматическим ре-прессором.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

3. Взаимодействие фага с бактериальной клеткой

По механизму взаимодействия различают вирулентные и умеренные  фаги. Вирулентные фаги, проникнув  в бактериальную клетку, автономно  репродуцируются в ней и вызывают лизис бактерий. Процесс взаимодействия вирулентного фага с бактерией протекает  в виде нескольких стадий и весьма схож с процессом взаимодействия вирусов человека и животных с  клеткой хозяина. Однако для фагов, имеющих хвостовой отросток с  сокращающимся чехлом, он имеет особенности. Эти фаги адсорбируются на поверхности  бактериальной клетки с помощью  фибрилл хвостового отростка. В результате активации фагового фермента АТФазы происходит сокращение чехла хвостового отростка и внедрение стержня в клетку. В процессе «прокалывания» клеточной стенки бактерии принимает участие фермент лизоцим, находящийся на конце хвостового отростка. Вслед за этим ДНК фага, содержащаяся в головке, проходит через полость хвостового стержня и активно впрыскивается в цитоплазму клетки. Остальные структурные элементы фага (капсид и отросток) остаются вне клетки.

После биосинтеза фаговых компонентов и их самосборки в бактериальной клетке накапливается до 200 новых фаговых частиц. Под действием фагового лизоцима и внутриклеточного осмотического давления происходит разрушение клеточной стенки, выход фагового потомства в окружающую среду и лизис бактерии. Один литический цикл (от момента адсорбции фагов до их выхода из клетки) продолжается 30 - 40 мин. Процесс бактериофагии проходит несколько циклов, пока не будут лизированы все чувствительные к данному фагу бактерии.

Взаимодействие фагов  с бактериальной клеткой характеризуется  определенной степенью специфичности. По специфичности действия различают  поливалентные фаги, способные взаимодействовать  с родственными видами бактерий, моновалентные фаги, взаимодействующие с бактериями определенного вида, и типовые фаги, взаимодействующие с отдельными вариантами (типами) данного вида бактерий.

Умеренные фаги лизируют не все клетки в популяции, с частью из них они вступают в симбиоз, в результате чего ДНК фага встраивается в хромосому бактерии. В таком случае геномом фага называют профаг. Профаг, ставший частью хромосомы клетки, при ее размножении реплицируется синхронно с геном бактерии, не вызывая ее лизиса, и передается по наследству от клетки к клетке неограниченному числу потомков. Биологическое явление симбиоза микробной клетки с умеренным фагом (профагом) называется лизогенией, а культура бактерий, содержащая профаг, получила название лизогенной. Это название (от греч. lysis -- разложение, genea -- происхождение) отражает способность профага самопроизвольно или под действием ряда физических и химических факторов исключаться из хромосомы клетки и переходить в цитоплазму, т.е. вести себя как вирулентный фаг, лизирующий бактерии.

Лизогенные культуры по своим основным свойствам не отличаются от исходных, но они невосприимчивы к повторному заражению гомологичным или близкородственным фагом и, кроме того, приобретают дополнительные свойства, которые находятся под контролем генов профага. Изменение свойств микроорганизмов под влиянием профага получило название фаговой конверсии. Последняя имеет место у многих видов микроорганизмов и касается различных их свойств: культуральных, биохимических, токсигенных, антигенных, чувствительности к антибиотикам и др. Кроме того, переходя из интегрированного состояния в вирулентную форму, умеренный фаг может захватить часть хромосомы клетки и при лизисе последней переносит эту часть хромосомы в другую клетку. Если микробная клетка станет лизогенной, она приобретает новые свойства. Таким образом, умеренные фаги являются мощным фактором изменчивости микроорганизмов.

Умеренные фаги могут нанести  вред микробиологическому производству. Так, если микроорганизмы, используемые в качестве продуцентов вакцин, антибиотиков и других биологических веществ, оказываются лизогенными, существует опасность перехода умеренного фага в вирулентную форму, что неминуемо  приведет к лизису производственного штамма.

Фаги размножаются только за счет паразитирования в микробной  клетке. Их размножение в бульонной  культуре приводит к тому, что культура, бывшая перед добавлением фага мутной, через несколько часов инкубации  при 37 °С становится прозрачной. На плотных средах фаги обнаруживают либо с помощью спот - теста, либо методом агаровых слоев, предложенным А. Грациа . В первом случае на поверхность агара в чашке засевают культуру, а затем на нее наносят каплю содержащего фаг материала. Если в нем содержится много вирионов, то на месте нанесения капли будет большое стерильное пятно (англ. spot - пятно).

Метод агаровых слоев заключается  в следующем. Вначале в чашку  наливают слой питательного агара. После застывания на этот слой добавляют 2 мл расплавленного и охлажденного до 45 °С 0,7% - ного агара, в который предварительно добавляют каплю концентрированной суспензии бактерий и определенный объем суспензии фага. После того, как верхний слой застынет, чашку помещают в термостат. Бактерии размножаются внутри мягкого слоя агара, образуя сплошной непрозрачный фон, на котором хорошо видны колонии фага в виде стерильных пятен . Каждая колония образуется за счет размножения одного исходного фагового вириона. Применение этого метода позволяет:

а) путем подсчета колоний  точно определить количество жизнеспособных фаговых вирионов в данном материале;

б) по характерным признакам (размер, прозрачность и др.), изучать  наследственную изменчивость V фагов.