Представление о бактериофаге

По спектру действия на бактерии фаги подразделяются на поливалентные (лизируют родственные бактерии, например поливалентный сальмонеллезный фаг лизирует почти все сальмонеллы), монофаги (лизируют бактерии только одного вида, например фаг Vi - I лизирует только возбудителей брюшного тифа) и типоспецифические фаги, которые избирательно лизируют отдельные варианты бактерий внутри вида. С помощью таких фагов производится наиболее тонкая дифференциация бактерий внутри вида, с разделением их на фаговарианты. Например, с помощью набора фагов Vi - II возбудитель брюшного тифа делится более чем на 100 фаговариантов. Поскольку чувствительность бактерий к фагам является относительно стабильным признаком, связанным с наличием соответствующих рецепторов, фаготипирование имеет важное диагностическое и эпидемиологическое значение.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

4. Методы культивирования бактериальных вирусов (фагов) и их индикация

Бактериофаги широко распространены в окружающей среде - водоемах, почве. Фаги кишечных бактерий (кишечной палочки, шигелл, сальмонелл) могут быть выделены из сточных вод и испражнений. Фаги стафилококков обнаруживают в слизи из носоглотки, на коже и в раневом отделяемом, фаги клостридий, вызывающих анаэробную раневую инфекцию, - в раневом отделяемом, почве. Наличие фага в среде указывает на присутствие чувствительных к нему бактерий.

Существуют вирулентные  и умеренные фаги. Вирулентные фаги вызывают продуктивную инфекцию, заканчивающуюся образованием новых фаговых частиц и лизисом бактериальных клеток. Умеренные фаги вызывают интегративную инфекцию, не приводящую к лизису зараженных ими клеток. ДНК этих фагов включается в хромосому бактерий и передается при их делении неограниченному числу потомков. Такой тип взаимодействия фага с клеткой называют лизогенией, а бактерии, несущие в своей хромосоме фаговую ДНК (профаг), являются лизогенными. Под действием различных факторов в клетках лизогенных бактерий может происходить индукция профага -- выщепление его ДНК из хромосомы бактерии и развитие продуктивной инфекции. Лизогенные фаги широко распространены в природе.

Репродукция вирулентного фага в клетках бульонной бактериальной  культуры сопровождается лизисом бактерий и просветлением среды. На газоне чувствительных бактерий, выращенных на плотной питательной среде  в чашке Петри, фаги образуют зоны очагового или сплошного лизиса, что зависит от их концентрации. Зоны очагового лизиса получили название негативных колоний фага, или стерильных пятен -- бляшек .

Они имеют морфологию, характерную  для определенных фагов, и образуются из одной фаговой частицы при ее внедрении и последующей репродукции в бактериальных клетках. Каждая инфицированная фагом бактерия лизируется и освобождает потомство фага, состоящее из сотен новых фаговых частиц. Они внедряются в интактные клетки, и весь цикл повторяется. В результате лизиса клеток на сплошном бактериальном газоне появляются негативные колонии фага.

Для получения "чистой" линии фага (свободной от примеси  других фагов) проводят последовательные пассажи морфологически однотипных негативных колоний на газоне одного и того же бактериального штамма.

Большинство фагов характеризуется видоспецифичностью в отношении бактерий. Однако существуют фаги, которые могут поражать только отдельные варианты одного и того же вида бактерий. Их используют для определения фаготипов (фаговаров) внутри данного вида. Вместе с тем имеются фаги, лизирующие родственные виды бактерий.

В практической работе фаги применяют для:

1) фаготипирования бактерий, т.е. определения фаготипа по лизису штаммов бактерий одного и того же вида типоспецифическими фагами, что важно для маркировки исследуемых бактерий при эпидемиологическом анализе заболеваний;

2) фагоидентификации бактериальных культур с целью установления их видовой принадлежности;

3) фагодиагностики, заключающейся  в выделении фага из организма  больного (например, из испражнений), что косвенно свидетельствует  о наличии в материале соответствующих  бактерий;

4) фагопрофилактики - предупреждения  некоторых заболеваний (например, дизентерии) среди лиц, находящихся  в эпидемическом очаге;

5) фаготерапии - лечения  некоторых инфекционных заболеваний,  вызванных, например, шигеллами, протеем, стафилококком.[3]

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

5. Качественный метод определения фагов E.coli

Чашку Петри с питательным агаром засевают суточной бульонной культурой кишечной палочки газоном и подсушивают при 37 °С в течение 10--15 мин. Затем на поверхность газона наносят каплю фага и наклоняют так, чтобы капля стекла к противоположному краю. После суточной инкубации в термостате просматривают чашку, отмечая наличие зоны лизиса по месту стекания капли фага.

6. Количественный метод - определение титра фага по методу Грациа

Для постановки опыта предварительно:

а) разливают питательный  агар в чашки Петри, подсушивают в термостате;

б) приготовленный полужидкий (0,7 %) питательный агар, разлитый по 3 - 4 мл в пробирки, растапливают в водяной бане. Делают 10-кратные разведения исследуемого фага (10^-2 - 10^-7 в зависимости от предполагаемого титра) в изотоническом растворе хлорида натрия. Затем 0,5 мл из последнего разведения фага (10^-7) смешивают с таким же объемом суточной бульонной культуры чувствительных к фагу бактерий и выливают в пробирку с полужидким агаром, охлажденным до 45 ⁰С. Смесь быстро выливают на поверхность агара в чашке Петри, где она застывает в виде тонкого слоя.

Так же готовят смесь из следующего разведения фага (10^-6) с бактериями и полужидким агаром и выливают на поверхность агара в другой чашке, затем - из разведения 10^-5. После застывания второго слоя агара чашки инкубируют при 37⁰ С, затем подсчитывают число негативных колоний фага. Число этих колоний соответствует количеству фаговых частиц в засеянной смеси. Исходя из него, можно вычислить количество пятнообразующих единиц в 1 мл исходной суспензии фага. Эта величина, характеризующая концентрацию фага, называется его титром.

Список литературы

1. А.А. Воробьёв, А.С. Быков. Е.П. Пашков, А.М. Рыбакова. Микробиология. Москва «Медицина». 1998.

2. Руководство к практическим занятиям по медицинской микробиологии, вирусологии и иммунологии. Пол ред. В.В. Теца. Москва «Медицина». 2002.

3. А.И. Коротяев, А.И. Бабичев. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология. Учебник для мед. Вузов. СПб: СпецЛит. 2002