Строение эндокринной системы

                                                                                                             Рис. 5

 

2.2. Методы  исследования функционирования  эндокринной системы

      Для исследования возрастного изменения строения и функционирования эндокринной системы используют следующие методы диагностики: общие лабораторные методы (клинические и биохимические), гормональное исследование, инструментальные методы, молекулярно-генетические методы.

Радиоиммунный метод.

     При  гормональном исследовании  может быть выявлено снижение продукции того или иного  гормона, повышение и его нормальный уровень. Наиболее часто используемыми в клинической практике методами определения гормонов являются различные модификации радиоиммунного метода. Эти методы основаны на том, что меченный радиоактивной меткой гормон и гормон, содержащийся в исследуемом материале, конкурируют между собой за связывание со специфическими антителами: чем больше в биологическом материале содержится данного гормона, тем меньше свяжется меченых молекул гормона, так как количество гормонсвязывающих участков в образце постоянно.

    В  современных методах исследования  применяются либо антитела, либо  сывороточные белки, связывающие  определенный гормон или лиганд и несущий радиоактивную метку-гормон, конкурирующий со стандартным гормоном или гормоном, присутствующим в биологической пробе.

    Принцип радиорецепторного метода  по существу не отличается от радиоиммунологического, только гормон, вместо того чтобы связываться с антителами, связывается со специфическим гормональным рецептором плазматической мембраны или цитозоля. Специфические рецепторы большинства полипептидных гормонов располагаются на наружной поверхности плазматической мембраны клеток, тогда как рецепторы биологически активных стероидов, а также тироксина и трийодтиронина — в цитозоле и ядрах. Чувствительность радиорецепторного анализа ниже, чем радиоиммунологического и большинства биологических методов в системах in vitro. Для того чтобы взаимодействовать со своим рецептором, гормон должен иметь соответствующую конформацию, т. е. быть биологически активным. Возможна ситуация, в которой гормон теряет способность связываться со своим рецептором, но продолжает взаимодействовать с антителами в системе для радиоиммунологического анализа. Это расхождение отражает тот факт, что антитела и рецепторы «узнают» разные участки молекулы гормона. Предложен ряд  радиорецепторных методов гормонального  анализа.

    Обычно получают ткань  специфического для данного гормона органа-мишени и с помощью стандартных методик  выделяют из нее рецепторы. Изолированные  рецепторы  плазматической мембраны в осадке при хранении в условиях температуры менее -20°С относительно стабильны. Однако солюбилизированные рецепторы полипептидных и стероидных гормонов, выделенные из плазматических мембран либо из цитозоля и не связанные с лигандами, оказываются нестабильными, что проявляется снижением их способности связывать специфические гормоны, даже если они хранились в замороженном виде, сравнительно недолго.

Иммунноанализ.

      В последнее  время наибольшее распространение получили нерадиоактивные методики. В качестве стандартного метода определения различных соединений в клинической химии все большее распространение получает иммуноанализ, отличающийся хорошей чувствительностью, специфичностью и широкой сферой применения. В частности, иммуноанализ применяют для определения гормонов. К числу таких методов относятся:

1. иммуноферментный анализ (ИФА), твердофазный ИФА типа ELISA или

гомогенный  ИФА типа EMIT,

2. флуоресцентный иммуноанализ (ФИА), базирующийся на измерении усиления, гашения или поляризации флуоресценции или на изучении флуоресценции с разрешением во времени,

3. био- или хемилюминесцентный иммуноанализ.

     Методика должна:

1. быть применимой  как для двухсайтового иммунометрического  анализа белков, так и для прямых  конкурентных анализов гаптенов, основанных на принципе связывания,

2. иметь соответствующие  чувствительность, точность и рабочий  диапазон определяемых концентраций с минимальным разбросом результатов во всем диапазоне,

3.легко совершенствоваться с целью дальнейшего повышения чувствительности и упрощения анализа.

     Потенциально  в методике должна быть заложена  возможность ее усовершенствования  и применения к анализам других веществ, внелабораторным и безразделительным анализам и к одновременному определению нескольких веществ (так называемому множественному иммуноанализу). Идеальным методам иммуноанализа, в наибольшей степени, соответствуют люминесцентные или фотоэмиссионные методы, в которых детекция метки проводится по регистрации излучения света.

    Люминесценция - это эмиссия света веществом, находящимся в электронно-возбужденном состоянии. Существуют несколько типов люминесценции, различающихся только источниками энергии, которая переводит электроны в возбужденное состояние, т.е. на более высокий энергетический уровень, а именно:

1. радиалюминесценция, в которой возбуждение соответствующего флуорофора достигается за счет поглощения энергии, выделяющейся в процессе необратимого радиоактивного распада. Возбужденный флуорофор излучает свет, возвращаясь в основное состояние,

2. хемилюминесценция, в которой возбуждение достигается в результате химической реакции (обычно необратимой реакции окисления). Если химическая реакция осуществляется в биологических системах под действием ферментов, то в этом случае обычно употребляют термин биолюминесценция. Если химическая реакция инициируется повышением температуры реагентов, то такой тип люминесценции называют термохемилюминесценцией,  если же реакцию инициирует электрический потенциал, то соответствующее явление называют электрохемилюминесценцией,

3.фотолюминесценция, в которой возбуждение вызывают фотоны инфракрасного, видимого или ультрафиолетового света.

     Фотолюминесценцию можно далее подразделить на флуоресценцию, когда возбужденная молекула быстро возвращается в исходное состояние через синглетное состояние, и фосфоресценцию, когда возбужденная молекула возвращается в исходное состояние через триплетное состояние. Эмиссия фосфоресценции затухает намного медленнее. Испускаемые кванты света имеют большую длину волны. Фотолюминесценция отличается от радио- и хемилюминесценции тем, что она обычно обратима, и поэтому в данной системе ее можно индуцировать повторно (поскольку образование возбужденного интермедиата и последующая его инактивация путем эмиссии света не приводят к химическим превращениям).

Хроматография.

     Кроме  этих методов, своё значение  полностью не потеряли химические  методы определения ряда веществ (обычно это метаболиты гормонов и их предшественников). Для очистки белковых фракций и изучения гормонов часто используют хроматографию. Жидкостная хроматография находит широкое применение в качестве экспрессного и селективного аналитического метода при разделении и идентификации различных веществ. Жидкостная хроматография (ЖХ) в ее классическом варианте (при атмосферном давлении) и высокоскоростная, или ВЭЖХ при повышенном давлении - оптимальный метод анализа химически и термически нестойких молекул, высокомолекулярных веществ с пониженной летучестью, что объясняется особой ролью подвижной фазы: в отличие от газообразной элюент в ЖХ выполняет не только транспортную функцию. Природа и строение компонентов подвижной фазы контролируют хроматографическое поведение разделяемых веществ. Среди наиболее типичных объектов жидкостной хроматографии белки, нуклеиновые кислоты, аминокислоты, красители, полисахариды. Жидкостная хроматография, в свою очередь, разделяется на жидкостно-адсорбционную (разделение соединений происходит за счет их различной способности адсорбироваться и десорбироваться с поверхности адсорбента), жидкостно-жидкостную, или распределительную (разделение осуществляется за счет различной растворимости в подвижной фазе - элюенте и неподвижной фазе, физически сорбированной или химически привитой к поверхности твердого адсорбента), ионообменную хроматографию, где разделение достигается за счет обратимого взаимодействия анализируемых ионизирующихся веществ с ионными группами сорбента - ионита. Особое место в использовании методов жидкостной хроматографии в медицине занимают гель-хроматография и аффинная, т.е. биоспецифическая хроматография. В основе этого варианта ЖХ лежит принцип разделения смеси веществ по их молекулярным массам. В гель-хроматографии молекулы веществ разделяются по размеру за счет их различной способности проникать в поры сорбента. Подвижная фаза - жидкость, а неподвижная - та же жидкость, заполнившая поры сорбента (геля). Если молекулам анализируемого вещества недоступны эти поры, то соответствующее соединение выйдет из колонки раньше, чем то, у которого размеры молекул меньше. Молекулы или ионы, размеры которых находятся между максимальным и минимальным диаметром пор геля, разделяются на отдельные зоны. Особенно интенсивное развитие гель-хроматография получила в последние два десятилетия, чему способствовало внедрение в химическую и биохимическую практику сефадексов - декстрановых гелей, поперечно сшитых эпихлоргидрином. На различных типах сефадексов можно фракционировать химические вещества с различными молекулярными массами, поэтому их широко используют для выделения и очистки биополимеров, пептидов, олиго- и полисахаридов, нуклеиновых кислот и даже клеток (лимфоцитов, эритроцитов), в промышленном производстве различных белковых препаратов, в частности ферментов и гормонов. Аффинная хроматография отличается чрезвычайно высокой избирательностью, присущей биологическим взаимодействиям. Нередко одна хроматографическая процедура позволяет очистить нужный белок в тысячи раз. Это оправдывает затраты усилий на приготовление аффинного сорбента, что не всегда оказывается легкой задачей ввиду опасности утраты биологическими молекулами способности к специфическому взаимодействию в ходе их ковалентного присоединения к матрице.

Инструментальные  методы исследования.

       Из  инструментальных методов исследования наиболее часто используют ультразвуковое исследование (УЗИ), рентгенографию, компьютерную томографию (КТ), и магнитно-резонансную томографию (МРТ). Кроме того, в эндокринологии применяют специальные методы: ангиографию с селективным забором крови, оттекающей от эндокринной железы, радиоизотопное исследование (сцинтиграфия щитовидной железы), денситометрия костей.

Молекулярно-генетические методы исследования.

    В  настоящее  время имеется два направления  ДНК-диагностики: гибридизационный анализ нуклеиновых кислот и диагностика с использованием полимеразной цепной реакции.

    Все  подходы  к генодиагностике могут быть выделены в несколько основных групп.

1.Методы  идентификации определенных участков ДНК.

2.Методы  определения  первичной  последовательности нуклеотидов в ДНК.

3.Методы  определения содержания ДНК и  анализа клеточного цикла.

    ПЦР  позволяет  найти в исследуемом материале  небольшой  участок 

генетической  информации, заключенный  в  специфической последовательности нуклеотидов ДНК  любого организма среди огромного  количества других участков ДНК и  многократно размножить его. ПЦР – это "in vitro" аналог биохимической  реакции синтеза ДНК в клетке.

    ПЦР  — это циклический процесс, в каждом цикле которого происходит тепловая денатурация двойной цепи ДНК-мишени, последующее присоединение коротких олигонуклеотидов-праймеров и наращивание их с помощью ДНК-полимеразы путем присоединения нуклеотидов. В результате накапливается большое количество копии исходной ДНК-мишени, которые легко подаются детекции.

Цитохимические  методы исследования.

   Эти методы  представляют собой варианты описанных  биологических исследований in vitro. Они  обычно обладают большей чувствительностью, чем  радиоиммунологические методы, но значительно более громоздки  и дороги при расчете на одно определение. Результаты цитохимических биологических  исследований количественно оценивают  на гистологических срезах с помощью  специального устройства —  микроденситометра.

   Гистологические срезы готовят из специфических для данного гормона тканей или клеток-мишеней, до того подвергшихся воздействию разных концентраций стандартного и испытуемого гормона. С помощью денситометра сканируют область диаметром  250-300нм для количественной оценки цветной реакции, обусловленной изменением состояния объекта под влиянием гормональной стимуляции. Для количественного анализа используют гистологические красители, чувствительные к этим изменениям.

   Первая  система цитохимического биологического исследования была разработана для  АКТГ, и тканью-мишенью в этой системе  служила кора надпочечников. Другие способы биологического определения  АКТГ либо слишком малочувствительны, либо требуют больших объемов  плазмы. Таким образом, цитохимическое определение  состояния ткани  является ценным средством анализа  нормальной и измененной функции  системы гипоталамус—гипофиз—надпочечники по уровню АКТГ.  
Чувствительные специфические цитохимические методы предложены для определения паратгормона, АДГ и тиротропина. При дальнейшем усложнении оборудования, этот метод  может  найти более широкое

применение. При  изучении функционального  состояния  эндокринных  желез  используются следующие  методические подходы:

1.Определение  исходного уровня того или  иного гормона.

2.Определение  уровня гормона в динамике  с учетом циркадного ритма  секреции.

3.Определение  уровня гормона в условиях  функциональной пробы.

4.Определение  уровня метаболита гормона. 

      Наиболее  часто в клинической практике используется определение 

базального  уровня того или  иного  гормона. Обычно кровь берётся натощак

утром, хотя приём пищи не отражается на продукции  многих гормонов. Для оценки деятельности многих эндокринных желёз (щитовидной, паращитовидных) оценки базального уровня гормонов вполне достаточно. При определении  базального уровня гормона  определённые сложности могут возникнуть в  связи с циркуляцией в крови  нескольких молекулярных форм одного и того же гормона. В первую очередь  это касается паратгормона.

    Уровни  большинства гормонов имеют характерную  суточную динамику (циркадианный ритм секреции), при этом очень часто  это динамика приобретает клиническое  значение. Наиболее важна и иллюстративна  в этом плане динамика продукции  кортизола. Другими примерами в этом плане являются пролактин и гормон роста, ритм секреции которых также определяется циклом «сон-бодрствование». В основе патогенеза ряда эндокринных  заболеваний лежит  нарушение суточного 

ритма продукции  гормона.

     Помимо  циркадианного ритма, на уровне гормона  в  крови  может отражаться большинство  биологических параметров. Для многих гормонов референтные показатели в значительной мере зависят от возраста , пола, фазы менструального цикла. 

  Основополагающим  принципом оценки деятельности гипофиз-зависимых (щитовидная железа, кора надпочечников, гонады) и ряда других эндокринных желёз является определение так называемых диагностических пар гормонов. В большинстве случаев продукция гормона регулируется механизмом отрицательной обратной связи. Обратная связь может иметь место между гормонами, принадлежащими к одной системе (кортизол и АКТГ), или между гормонами и его биологическим эффектором (паратгормон и кальций). Кроме того, между гормонами, составляющими пару, не обязательно должно существовать прямое взаимодействие. Иногда оно опосредовано другими гуморальными факторами, электролитами и физиологическими параметрами (объем почечного кровотока, уровень калия и ангиотензин для пары ренин-альдостерон). Изолированная оценка показателей, составляющих пару, может стать причиной ошибочного заключения.