Трансге́нный органи́зм

Трансге́нный  органи́зм — живой организм, в  геном которого искусственно введен ген другого организма.Ген вводится в геном хозяина в форме  так называемой «генетической конструкции» — последовательности ДНК, несущей  участок, кодирующий белок, и регуляторные элементы (промотор, энхансер и пр.), а также в некоторых случаях элементы, обеспечивающие специфическое встраивание в геном (например, т. н. «липкие концы»). Генетическая конструкция может нести несколько генов, часто она представляет собой бактериальную плазмиду или ее фрагмент.Целью создания трансгенных организмов является получение организма с новыми свойствами. Клетки трансгенного организма производят белок, ген которого был внедрен в геном. Новый белок могут производить все клетки организма (неспецифическая экспрессия нового гена), либо определенные клеточные типы (специфическая экспрессия нового гена).

Создание трансгенных  организмов используют:в научном  эксперименте для развития технологии создания трансгенных организмов, для  изучения роли определенных генов и белков, для изучения многих биологических процессов; огромное значение в научном эксперименте получили трансгенные организмы с маркерными генами (продукты этих генов с легкостью определяются приборами, например зелёный флуоресцентный белок, визуализируют с помощью микроскопа, так легко можно определить происхождение клеток, их судьбу в организме и т. д.);в сельском хозяйстве для получения новых сортов растений и пород животных;в биотехнологическом производстве плазмид и белков.

В настоящее  время получено большое количество штаммов трансгенных бактерий, линий трансгенных животных и растений. Близко по смыслу и значению к трансгенным организмам находятся трансгенные клеточные культуры. Ключевым этапом в технологии создания трансгенных организмов является трансфекция — внедрение ДНК в клетки будущего трансгенного организма. В настоящее время разработано большое количество методов трансфекции. В русской научной литературе существовали попытки ввести термины «трансгенез», «трансгеноз» и «трансгенология» для технологии создания трансгенных организмов и соответствующей области знания, но эти термины используются редко.

Близко по значению к термину «трансгенный организм»  стоит термин «трансфицированный организм»  — организм, в клетки которого был  осуществлен перенос гена другого организма. Этот термин иногда используют, когда акт трансфекции осуществлен, но экспрессия нового гена отсутствует. Также этот термин используется для описания организма, в часть клеток которого введена генетическая конструкция (например, введение ДНК в один из органов взрослого животного, в этом случае новый ген не будет передан потомству, а его экспрессия зачастую носит временный характер).

Близко по значению к термину «трансгенный организм»  стоит термин «Генетически модифицированный организм», но это понятие шире и включает в себя не только трансгенные организмы, но и организмы с любыми иными изменениями генома.

Многие, наверное, слышали такие слова как ГМО, трансгенные организмы или просто трансгены. Мы постараемся разобраться, что же это такое и как их получают. Сейчас ученые способны переносить и встраивать гены из геномов одних организмов в геномы любых других организмов, относящихся ко всем царствам живого. Такие организмы со встроенными чужеродными генами и называют генетически модифицированными организмами — ГМО или трансгенными организмами. К настоящему времени уже создано много таких изменённых организмов. Это и бактерии, производящие инсулин, и другие необходимые человеку соединения, и животные, дающие, например, молоко со свойствами грудного женского молока, а также множество растений, которые или устойчивы к каким-то соединениям, например, к гербицидам, или сами вырабатывают какие-то полезные человеку белки, например, вакцины или антитела. ГМО создают с помощью генно-инженерных технологий или генной инженерии.

Генная инженерия  — направление исследований в  молекулярной биологии и генетике, конечной целью которой является получение организмов с новыми, в  том числе не встречающимися в  природе комбинациями наследственных свойств. В её основе лежат достижения молекулярной биологии и, прежде всего, установление универсальности генетического кода (у всех организмов включение одних и тех же аминокислот в строящуюся полипептидную цепь белка кодируется одними и теми же последовательностями трех нуклеотидов в цепи ДНК). Кроме того, успехам генной инженерии способствовала разработка возможности объединения in vitro (в пробирке) генов, выделенных из различных источников, в одну молекулу ДНК, т.е. создание рекомбинантных молекул. Поэтому генную инженерию называют ещё и техникой рекомбинантных ДНК. Таким образом, генная инженерия - это совокупность приемов, позволяющих исследователю путём операций in vitro перенести генетический материал из одного организма (который принято называть источником генов) в другой (называемый хозяином или реципиентом) так, чтобы обеспечить наследование этих генов в новом для них организме. Перенос генов методами генной инженерии дает возможность преодолевать межвидовые барьеры и передавать отдельные наследственные признаки одних организмов другим (например, от человека или животного - бактериям, растениям и др.).

Каковы возможности  генной инженерии?  
1. Можно «скрещивать» индивидуальные гены видов, стоящих на разных ступенях эволюции.  
2. Можно управлять процессом рекомбинации, так как он происходит в пробирке и не защищен запрещающими механизмами организма.  
3. Заранее можно предсказать результат скрещивания, т.к. отбирается потомство одной молекулы ДНК (молекулярное клонирование).

Как же можно  с помощью генной инженерии создать ГМО и какие методы существуют для этого?  
Для того чтобы получить трансгенные организмы нужно выполнить несколько последовательных действий.  
Во-первых, надо создать вектор, то есть самостоятельно реплицирующуюся молекулу ДНК. Термин репликация (от позднелат. replicatio — повторение) обозначает самовоспроизведение нуклеиновых кислот (обычно ДНК, у некоторых вирусов РНК), обеспечивающее точное копирование генетической информации и передачу ее от поколения к поколению. При репликации ДНК нуклеотидная последовательность копируется (целиком или частично) в виде комплементарной последовательности, т.е. последовательности, у которых структуры двух молекул соответствуют в пространстве, благодаря чему возможно образование между ними водородных связей и осуществление межмолекулярных взаимодействий. Вектор способен включать чужеродную ДНК (гены) и переносить ее в клетки, наследственные свойства которых желают изменить. Векторами они названы за способность осуществлять процесс переноса направленно, по желанию экспериментатора.  
Во-вторых, надо знать, какой ген необходимо встроить в организм, чтобы придать ему желательные свойства, и иметь этот ген.  
В-третьих, надо разработать методы переноса, чтобы векторная молекула с необходимыми генами проникла в клетки изменяемого организма и встроила в клеточный геном чужеродные гены.  
И, в-четвертых, необходимо правильное конструирование векторной молекулы, чтобы встроенный ген полноценно экспрессировался в клетке. Существуют различные типы векторов с разными свойствами. Однако обычно их создают на основе ДНК плазмид или вирусов (в том числе бактериофагов).

Плазмиды —  это кольцевые двухцепочечные молекулы ДНК, способные размножаться (реплицироваться) в клетке независимо от цикла размножения  клетки. «Дикие» плазмиды очень широко распространены в природных бактериальных популяциях и способны передаваться от одной бактериальной клетки к другой в процессе «конью-гации» — аналога полового размножения. Многие плазмиды содержат гены, которые придают содержащим их бактериям некоторые фенотипические признаки, такие, как устойчивость к антибиотикам, солям тяжелых металлов и т. д. Наличие в плазмидах таких генов делает их присутствие в бактериальных клетках выгодным и способствует их размножению. Плазмиды стали настоящим подарком для молекулярных биологов, сейчас на их основе созданы многие современные «векторные» системы, используемые в генной инженерии. Если основная бактериальная ДНК имеет длину более 100 тысяч пар оснований, то размеры плазмид составляют всего несколько тысяч пар оснований. Они легко выделяются и очищаются.

Большое количество векторов создано на основе бактериофагов. Они позволяют вводить чужеродную ДНК в ДНК-фаг. Причем, вставляемый  фрагмент ДНК может быть значительно  большего размера, чем при использовании  плазмидного вектора.

ПОЛУЧЕНИЕ ГЕНОВ.Ген, который хотят ввести в трансформируемый организм, чтобы придать ему новые свойства, носит название целевого гена, или гена интереса.

Ген можно получить несколькими путями.  
1. Выделение гена из ДНК каких-то организмов, у которых определена нуклеотидная последовательность геномов и известна функция многих генов, например, из Arabidopsis thaliana, который является модельным растением во множестве исследований, или из бактерий, так как последовательность геномов многих бактерий в настоящее время известна. Выделение генов из ДНК проводят с помощью специальных ферментов рестрикт Эндонуклеазы рестрикции, рестриктазы (от лат. restrictio — ограничение) — группа ферментов, относящихся к классу гидролаз, катализирующих реакцию гидролиза нуклеиновых кислот. Рестриктазы расщепляют нуклеиновые кислоты не с конца молекулы, а в середине. При этом каждая рестриктаза узнаёт определённый участок ДНК длиной от четырёх до шести пар нуклеотидов и расщепляет нуклеотидную цепь внутри участка узнавания или вне его. Однако этот метод имеет существенные недостатки, так как достаточно трудно подобрать ферменты, которые могут точно вырезать из ДНК нужный ген. Вместе с последовательностью его нуклеотидов захватываются «лишние» нуклеотиды или, наоборот, ферменты отрезают часть гена, превращая его в функционально неполноценный.  
2. Выделение гена из ДНК с помощью химико-ферментного или ферментного синтезов. Таким способом ген можно синтезировать, зная первичную структуру белка, кодируемого желаемым геном, или с помощью обратной транскрипции РНК, выделенной из соответствующего организма. Термин транскрипция (буквально — переписывание, от лат. trans— через, пере и scribo — черчу, пишу) — это процесс синтеза РНК с использованием ДНК в качестве матрицы; происходящий во всех живых клетках. Транскрипция катализируется ферментом, который называется ДНК-зависимая РНК-полимераза. Процесс синтеза РНК протекает в направлении от 5'- к 3'- концу,  
т.е. по матричной цепи ДНКРНК-полимераза движется в направлении 3->5. Ферментный синтез гена на основе выделенной матричной РНК (мРНК) является в настоящее время наиболее распространенным методом.

СОЗДАНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ КОНСТРУКЦИИ

Полученный тем  или иным способом ген содержит информацию о структуре белка, но сам не может  ее реализовать. Поэтому нужны дополнительные механизмы для управления действием гена — это структурные элементы: промоторы, которыми являются последовательности нуклэотидов ДНК, расположенные перед началом участка гена, кодирующего белок или РНК, и узнаваемые ферментом РНК-полимеразой как стартовая площадка для начала транскрипции, а также терминаторы и энхан-серы Терминатор — это последовательность нуклеотидов в молекуле ДНК, ответственная за прекращение транскрипции. Добавление терминаторов транскрипции предотвращает нежелательное прохождение через трансген РНК-полимеразы. Для растений часто используется терминатор-ная последовательность гена нопалинсин-тазы из Agrobacterium tumefaciens. Энхан-серы — последовательности ДНК, усиливающие транскрипцию при взаимодействии со специфическими белками. Они могут находиться в любой части генома, а их взаимодействие с работающим геном происходит за счет четвертичной структуры ДНК. Выбор промотора при создании трансгенных конструкций имеет особое значение. Существует общая закономерность: прокариотические промоторы могут обеспечить активность любого гена, в том числе и эука-риотического, только в прокариотическом организме. В эукариотическом организме может функционировать только ген, имеющий эукариотический промотор. Поэтому при переносе генов от одного вида растений (животных) к другому можно использовать гены с их собственными промоторами. Но, если в растительную (животную) клетку переносится бактериальный ген, то его прокариотический промотор должен быть заменен на соответствующий эукариотический. Для растений часто используют промоторы от растительных вирусов, которые эволюционно приспособлены к функционированию в растительной клетке.

 
Промотор может быть сильным и  слабым. Сильный промотор инициирует синтез мРНК часто, слабый — гораздо реже. При этом очень важно при конструировании вектора не изменять последовательность оснований промотора, которая определяет частоту инициации синтеза мРНК. Замена даже одного основания в этой последовательности может привести к уменьшению частоты инициации в 1000 раз. Ген должен быть встроен в векторную молекулу, способную доставить его в клетку растения, чтобы. создать специальную генетическую конструкцию, которая могла бы экспрессироваться, т.е. была бы активна в клетке. Экспрессия генов — это процесс, в котором наследственная информация гена (последовательности нуклеотидов ДНК) преобразуется в функциональный продукт — РНК или белок. Экспрессия генов может регулироваться на всех стадиях процесса: и во время транскрипции, и во время трансляции, и на стадии посттрансляционных модификаций белков. Существуют гены, кодирующие РНК (например, рРНК, тРНК), которые экспрессируются (транскрибируются), но не транслируются в белки.  
Таким образом, генетическая конструкция или генетическая кассета должны выглядеть, как на рис. 2.

Затем эту генетическую конструкцию встраивают в плазмиду, которую каким-либо образом вводят в клетку с тем, чтобы гены встроились в клеточный геном.

КАК ПОЛУЧАЮТ ГЕНЕТИЧЕСКИ  ИЗМЕНЕННЫЕ ОРГАНИЗМЫ?

Мы выяснили, что смысл генно-инженерных манипуляций состоит в переносе целевого гена в геном клетки-мишени и его экспрессии в новом генном окружении. Логика проведения такой манипуляции мало меняется в зависимости оттого, какой целевой ген будет использован и клетки какого организма подвергнутся изменению. Главное, что после получения трансформированной изменённой клетки из неё можно получить полноценный организм. При этом подходы к формированию организма зависят от того, какая клетка — бактериальная, растительная или животная — служила мишенью для трансформации.  
В случае бактериальной клетки либо клетки другого одноклеточного организма (например, дрожжей), получение трансгенного организма ограничивается непосредственным переносом гена в клетку-мишень. Клетка одноклеточных сама по себе — самостоятельный полноценный организм. Деление такой клетки приводит к появлению идентичных организмов с теми же свойствами, что были приобретены исходной трансгенной - материнской клеткой.

 
Для получения трансгенного животного  в качестве клетки-мишени используют половую клетку — яйцеклетку. После трансформации в ходе естественных процессов развития яйцеклетка превращается в полноценный автономный организм. Передача новых признаков в поколениях невозможна, если процесс трансформации не затронул половые клетки.