Трансге́нный органи́зм

 
Растения имеют важное преимущество перед животными, а именно — возможна их регенерация in vitro из недифференцированных соматических тканей с получением нормальных, фертильных растений. Это свойство (тотипотентность) дает возможность  получать генетически модифицированные (трансгенные) растения и изучать функционирование введенных в растения генов.

 
Вводить в геном растительных клеток гены, кодирующие нужный белок, пробовали  разными способами, однако они все  были малоэффективны. Удобный способ доставки чужих генов был подсказан самой природой — трансформация растений с помощью почвенных бактерий Agrobacterium tumefaciens или Agrobacterium rhizogenes.  Как и у большинства других бактерий, I часть их генома находится не в основной хромосоме, а в плазмидах. Ti-плазмиды (tumor-inducing, опухолеобразующие), найденные в Agrobacterium tumefaciens или Ri-плазмиды (root-inducing, корнеобразую-щие) в Agrobacterium rhizogenes, оказались лучшим инструментом для генной инженерии.

 
Агробактерии являются мезофильными обитателями почвы, среди них встречаются как сапрофитные (A. radiobacter), так и фитопатогенные (A. tumefaciens, A. rubi, A. rhizogenes, A. vinis) виды. Это короткие, подвижные грамотрицательные палочки с перитрихиальными жгутиками.  

Опухолевый рост у растений, индуцированный патогенными штаммами Agrobacterium, представляет собой особый случай паразитизма: паразит (агробак-терия) изменяет обмен веществ в клетках хозяина, вводя свою генетическую информацию в его геном. Такое явление получило название «генетическая колонизация». Ферментативный механизм растения, отвечающий за транскрипцию собственной ДНК и синтез белка, распознает чужеродную ДНК из бактерии как свою собственную и транскрибирует ее вместе с обычными растительными генами.

 
В природе образование опухоли начинается с повреждения стебля растения у самой земли. Агробактерии могут трансформировать растение только при наличии пораненной растительной ткани, которая теряет различные вещества, входящие в состав клеточных стенок (глюкозу, глюкуроновую кислоту, галактозу, галактуроно-вую кислоту, арабинозу, маннозу, фукозу, целлобиозу и ксилозу), а взамен в ней начинают синтезироваться специальные вещества — предшественники лигнина, являющиеся сигнальными молекулами для начала инфекции — ацетосирингон и гидро-ацетосирингон, способствующие залечиванию раны. 

Патогены чувствительны  к ним и начинают двигаться  к поврежденному участку ткани  по градиенту концентрации этих веществ  со скоростью 60 мкм/сек, а затем прикрепляются  к клеткам растения в местах повреждений. После прикрепления бактерий к поверхности клеток растения они начинают образовывать целлюлозные фибриллы, которые видны при микроско-пировании уже через 90 мин после добавления бактерий и к 10 часам инкубации формируют сеть, покрывающую поверхность растительных клеток. Фибриллы служат более прочному закреплению бактерий на поверхности хозяина. За целлюлозные фибриллы могут зацепиться свободно плавающие клетки бактерий, за счет чего увеличивается множественность заражения. В результате размножения образуются скопления бактерий на поверхности растения. Передача ДНК от бактерий в растительную клетку происходит при плотном контакте бактерий с плазмалеммой растительной клетки, который обеспечивается вследствие повреждения клеточных стенок ферментами, выделяемыми бактериями и растворяющими пектины клеточной стенки.

 
Для чего же нужно бактериям встраивать свои гены в клетки растения, изменяя  их метаболизм?  
В растениях со встроенных бактериальных генов начинается синтез фитогормонов цитокининов и специфических, используемых только агробактериями, веществ — опинов. Синтез дополнительного количества гормонов в растительной клетке приводит к сдвигу баланса гормонов в клетке и, как следствие, к неуправляемому росту клеток, ведущему к образованию опухоли. Эти вещества — опины используются бактериями в качестве источника углерода и азота, что создаёт для них селективные преимущества, т.к. только агробактерии имеют гены, ответственные за деградацию этих соединений.  
Геном A. tumefaciens состоит из 2-х частей — из большой линейной хромосомы (2 млн пар оснований) и значительно меньшей кольцевой хромосомы (206479 пар оснований). Именно эта кольцевая хромосома и носит название Ti-плазмиды (см. выше).

 
Гены, вызывающие формирование галлов на растении, локализованы по большей  части на Ti-плазмиде. Agrobacterium tumefaciens имеет очень широкий круг растений-хозяев и может инфицировать практически все двудольные растения. Долгое время считалось, что однодольные растения не чувствительны к агробакте-риальной инфекции. В настоящее время показано, что при соблюдении определенных условий агробактерии могут инфицировать и однодольные растения, в частности представителей таких семейств, как Amaryllidaceae, Liliaceae, Gramineae, Iridaceae и некоторых других. Однако существуют определенные вариации круга хозяев для различных штаммов Agrobacterium: некоторые штаммы способны вызывать галлообразование на отдельных видах растений, но не инфицируют другие. Различные сорта одного и того же растения также могут иметь различную чувствительность к данному бактериальному штамму. В отличие от A. tumefaciens, A. rhizogenes фактически инфицируют все виды растений, как двудольные, так и однодольные.

Ti-плазмида представляет  собой кольцевую двунитевую ДНК,  которая несет гены, участвующие  в образовании опухоли. В растение переносится часть плазмиды, которая называется Т-ДНК (от англ. transferred DNA, т.е. «переносимая ДНК»), на которой локализованы гены синтеза ферментов, вызывающих формирование опухолей на растении, а также гены синтеза опи-нов. Ti-плазмида содержит также w'r-гены, которые экспрессируются под воздействием сигнальных молекул и являются ответственными за синтез, вырезание и перенос Т-ДНК, но сами в геном растения не переносятся.

Индукция vir генов  обратима, и каскад реакций может  быть прерван, что очень важно для патогена, поскольку в том случае, если инфицируется больной и/или нежизнеспособный организм, то перенос Т-ДНК в его клетки не осуществляется. После активации w'r-генов в оболочке бактерии образуется разрыв, через который Т-ДНК переносится в растительную клетку. Похожим образом у бактерий происходит половой процесс, когда микробы просто обмениваются копиями плазмид.

 
Т-ДНК, являясьфрагментомТ1-плазмиды, ограничена двумя прямыми повторами из 25 нуклеотидов, которые «обманывают» ферменты растительной клетки, заставляя их принять Т-ДНК за родную и встроить ее в собственный геном. Правый конец обозначается П (RB — right border), левый соответственно Л (LB — left border). Для нормального переноса в растительную клетку особенно важна ее правая граница, которая одна может определять встраивание Т-ДНК. Удаление правой границы из Ti-плазмид делает агробактерии полностью неинфекционными. В то же время замена правой границы как на искусственно синтезированную, так и на левую восстанавливает вирулентность бактерии. Любой фрагмент ДНК, помещенный между этими границами, может быть перенесен и встроен в ядро растительной клетки. Максимальный размер фрагмента ДНК, который может быть перенесен, пока не определен.

На рисунке  приведена схема генетической трансформации клетки. Фенольные компоненты пораненной растительной клетки запускают экспрессию генов vir-области Ti-плазмиды. vir-белки вырезают Т-область из плазмиды, образуя Т-цепь. Затем Т-цепь и vir-белки нескольких типов переносятся в растительную клетку через транспортные каналы. Внутри клетки vir-белки взаимодействуют с Т-цепью, формируя Т-комплекс. Этот комплекс попадает в ядро, позволяя Т-ДНК интегрировать в геном растения и экспрессировать встроенные гены

После переноса в ядро растительной клетки Т-ДНК  встраивается в геном в виде одной или нескольких копий. При этом одна из нитей плазмидной ДНК деградирует, а другая за счет рекомбинации с гомологичным участком ДНК клетки-хозяина может включиться в хромосому или внехромосом-ную единицу.

У Ri-плазмид имеются  общие черты с Ti-плазмидой, в том числе гомологичная vir-область. Её Т-ДНК также содержит гены, кодирующие опины и два гена синтеза ауксина и, кроме того, ещё в ней присутствуют специальные гены, называемые гогенами, которые и способствуют образованию опухоли в виде пучка корней.

 
Ti- и Ri-плазмиды оказались прекрасным  инструментом для переноса генов  в хромосомы растений. В начале 80-х гг. XX в. различными группами  исследователей Ti-плазмиды были  модифицированы путем удаления  онкогенов (генов синтеза фито-гормонов и опинов) из области Т-ДНК; также из агробактерий была удалена вся лишняя ДНК, не нужная при клонировании ДНК. Клонирование в биологии — это получение точных копий организма или другого объекта, например, клетки или гена. Первоначально слово клон (от греч. ветка, побег) применялось для группы растений (например, фруктовых деревьев), полученных вегетативным способом от одного растения-производителя. Эти растения в точности повторяли качества своего прародителя и могли стать основателями нового сорта. Позже клоном стали называть не только всю такую группу, но и каждое отдельное растение в ней, а получение таких потомков — клонированием. 

Со временем значение термина расширилось, и  его стали применять в микробиологии, для методики выращивания культур  бактерий — потомков одной клетки. Кроме того, в Ti-плазмиду был также добавлен сайт инициации репликации, вырезанный из плазмиды кишечной палочки E, coli, чтобы можно было клонировать в ней плазмиды. После переноса с их помощью ДНК в ядро растительной клетки нормальный рост растения не нарушался. После этого оставалось вставить в Т-ДНК нужные гены: один или несколько целевых и не менее двух маркерных, которые позволяют отобрать сначала клетки кишечной палочки, а потом растительные, в которых перенос генов прошел удачно - ген устойчивости к определенному антибиотику или кодирующий светящийся белок, и т.п.

В растениях, трансформированных такими плазмидами, опухоли уже не образуются, и не происходит синтеза  опинов. «Обманутая» человеком бактерия, внедряя свою ДНК в хромосому растения, в свою очередь «обманывает» геном растения, который после этого начинает синтезировать необходимые человеку продукты.

МЕТОДЫ ПЕРЕНОСА ДНК В КЛЕТКИ РАСТЕНИЙ

В настоящее  время применяются две основные группы методов переноса ДНК в  клетки растений: прямые и агробактериальные.

I. Прямой перенос  ДНК в растительную клетку

При этом способе  используются различные химические и физические методы:  
электропорация, бомбардировка, микроинъекции, воздействие полиэтиленгликоля (ПЭГ), ионов Са2+ и высокие значения рН. Эти методы трудоемки и дорогостоящи, однако иногда без них не обойтись. В некоторых из этих методов (электропорация, воздействие ПЭГ, или ионов Са2+ и высокого рН) в качестве объекта для введения ДНК используются протопласты, т.е. клетки, лишенные клеточной стенки. Их получают, воздействуя на растительную ткань ферментами, растворенными в осмотике разрушающими пектин и целлюлозу - пек-тиназой (мацерозимом) и целлюлазой. Осмотик, в качестве которого используются многоатомные спирты (маннит или сорбит) или сахара (глюкоза или сахароза), необходим, чтобы протопласт после переваривания клеточной стенки не разрушился. После всех манипуляций протопласты высевают на питательную среду, где они образуют клеточную стенку, делятся и формируют колонии, из которых могут образоваться растения-регенеранты.

1. Электропорация  основана на том, что импульсы  тока высокого напряжения обратимо  увеличивают проницаемость биомембран. В среду для электропорации  добавляют протопласты (Пр) и плазмидную  ДНК, которую необходимо ввести в клетки. Через среду пропускают высоковольтные импульсы (напряжение 200-350В, длительность импульса 30-60 мс), приводящие к образованию пор (электропробой) в цито-плазматической мембране, время существования и размер которых достаточны, чтобы молекулы ДНК могли из внешней среды войти в клетку в результате действия осмотических сил.  
2. Трансформация протопластов с помощью ПЭГ, протопластов ионов Са и высоких значений рН. В этом методе для трансформации также используют протопласты, добавляя к ним специальные соединения (раствор ПЭГ, хлористый кальций, щелочь), добавляют плазмиду и инкубируют в течение 20-30 мин. ПЭГ и ионы Са2+ воздействуют на плазматическую мембрану, окружающую протопласты, удаляя с неё положительный заряд, отталкивающий молекулы ДНК. На нейтрально заряженную мембрану прикрепляется плазмидная ДНК и проходит в клетку за счет пиноцитоза. Пиноцитоз (от греч. pfno — пью, впитываю и kytos — вместилище, здесь — клетка) — захват клеточной поверхностью жидкости с содержащимися в ней веществами. Один из основных механизмов проникновения в клетку высокомолекулярных соединений, в частности белков и углеводно-белковых комплексов. При пиноцитозе на плазматической мембране клетки появляются короткие тонкие выросты, окружающие капельку жидкости. Этот участок плазматической мембраны впячивается, а затем отшнуро-вывается внутрь клетки в виде пузырька. Пиноцитозные пузырьки способны перемещаться внутри клетки, сливаться друг с другом и с внутриклеточными мембранными структурами. В клетке мембранная оболочка растворяется, и ДНК встраивается в геном клетки.

3. Трансформация с помощью биологической баллистики (биолистика или бомбардировка). Метод биологической баллистики (биолистики), несмотря на свою сложность, является одним из самых эффективных на сегодняшний день методов трансформации растений, особенно для трансформации однодольных видов. Суть метода заключается в том, что на мельчайшие частички инертного металла (вольфрам, титан, золото), диаметром 0,6-1,2 мкм, напыляется ДНК вектора, содержащего необходимую для трансформирования генную конструкцию. Металлические частички, несущие ДНК, наносятся на пластиковую пулю и помещаются внутрь биолистической (генетической) пушки на расстоянии 10-15 см над растительной тканью-мишенью. В пушке вакуумным насосом уменьшается давление до 0.1 атм. В момент сбрасывания давления частички металла с огромной скоростью выбрасываются из специального отверстия, над которым помещается пуля, и, разрывая клеточные стенки, входят в цитоплазму и ядро клеток.

Обычно клетки, располагающиеся непосредственно по центру, погибают из-за огромного количества и давления металлических частиц, в то время как в зоне 0.6-1 см от центра находятся наиболее удачно протрансформированные клетки. Далее клетки осторожно переносят на среду для дальнейшего культивирования и регенерации. Несомненным достоинством этого метода является то, что при его использовании могут быть трансформированы не только ядерные, но и органельные геномы.

II. Перенос ДНК с помощью  агробактерий  
Другая наиболее распространенная группа методов — трансформация с помощью Л. tumefaciens или Л. rhizogenes, имеющих генно-модифицированные плазмиды Ti или Ri. При агробактериальных методах переноса используется, как правило, метод совместного культивирования в течение некоторого времени (от 2-3 мин до 2-3 суток) с суспензией агробактерии (co-cultivation) растительных эксплантов, то есть кусочков каких-либо частей растения, которые затем переносят для регенерации каллуса или прямого побегообразования на среду, содержащую антибиотики для подавления роста бактерий.

Этот метод  достаточно универсален и пригоден для многих видов растений, хорошо образующих регенеранты. Таким способом к настоящему времени было получено большинство трансгенных растений различных генотипов. Однако сложностей хватает и при использовании агробактериальной трансформации. Основными трудностями являются — отсутствие универсальных методов переноса генов в клетку, сложность получения соответствующих систем культуры тканей и регенерации растений.

 
Регенерация (от позднелат. regeneratio — возрождение, возобновление) в биологии — восстановление организмом утраченных или поврежденных органов и тканей, а также восстановление целого организма из его части. Регенерация наблюдается в естественных условиях, а также может быть вызвана экспериментально. У растений регенерация может происходить на месте утраченной части или на другом месте организма. Обычно, однако, под регенерацией понимают восстановление насильственно отторженных частей. При такой регенерации организм, прежде всего, использует основные пути нормального развития. Поэтому регенерация органов у растений происходит преимущественно путём репродукции — отнятые органы компенсируются развитием существующих или образующихся вновь заложений. Так, при отрезании верхушки побега усиленно развиваются боковые побеги. Или поверхность ранения на стволе или ветке может покрыться так называемой раневой перидермой; а также рана может зарубцеваться наплывами (каллюсами). Размножение растений черенками или кусочками листьев — простейший случай регенерации, когда из небольшой вегетативной части восстанавливается целое растение.