Трансге́нный органи́зм

 
Успех получения трансгенных растений зависит от множества факторов, поэтому в каждом конкретном случае приходится подбирать строго индивидуальные условия трансформации для каждого генотипа растения.

ОТБОР ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ РЕГЕНЕРАНТОВ

После проведения процедуры трансформации, начинается процесс образования растений-регенерантов. Однако следует иметь в виду, что чужеродные гены будут находиться не во всех образовавшихся растениях. Как известно, частота трансформации (отношение числа эксплантов с трансформированными побегами к общему числу эксплантов), независимо от использованных методов трансформации, достаточно мала. В связи с этим в генетической инженерии растений, также как и в генетической инженерии животных, большое значение имеет возможность отбора трансформированных организмов.

 
Для этого обычно используются специально встраиваемые для этого в вектор селективные и маркерные гены. Наиболее распространенными селективными генами являются бактериальные гены устойчивости к антибиотикам (прокариот-ный  ген неомицинфосфотрансферазы nptll, придающий трансгенным растениям устойчивость к канамицину, или hpt ген — устойчивость к гигромицину) или гены, делающие растения устойчивыми к гербицидам (bar — к биалофосу; dhfr — к метотрексату; esps — к глифосату). При помещении эксплантов на среды, в которых присутствует селективный агент, образовавшиеся из трансформированных клеток побеги остаются живыми, а остальные погибают.

 
Однако использование селективных  соединений имеет свои недостатки. Хотя эти селективные гены эффективно экспрессируются в большинстве растений, но некоторые виды растений чрезвычайно чувствительны к самим селективным соединениям, что приводит к массовой гибели растительной ткани (даже трансформированной) на селективной среде. Другие же виды растений могут быть устойчивы к высокой концентрации селективного фактора, что также затрудняет отбор трансформантов. Кроме того, эффективность отдельных соединений как селективных агентов способна меняться в зависимости от типа выбранного экспланта или вида ткани.

 
В качестве маркерных генов часто используются какие-либо нерастительные гены, обусловливающие либо легко тестируемую энзиматическую активность, например, бактериальный ген gus, ферментный белок которого при взаимодействии со специальным субстратом окрашивает ткани растений в синий цвет. Также применяются гены-«репортеры» — индикаторные гены, например, ген зеленого флуоресцирующего белка медузы, gfp (green fluorescent protein), светящийся в ткани растения ярко-зелёным светом. При использовании маркерных генов важными факторами являются простота, дешевизна и специфичность методов детектирования.

ДОКАЗАТЕЛЬСТВО  ТРАНСГЕННОСТИ ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ РАСТЕНИЙ, Т.Е. НАЛИЧИЕ В ИХ ГЕНОМЕ ТРАНСГЕНА

После первоначального  отбора трансформированных растений или  тканей с помощью маркерных или  селективных генов необходимо доказать присутствие вводимого целевого гена с помощью различных молекулярных методов, таких как ПЦР или ДНК-гибридизация. ПЦР — полимеразная цепная реакция. Этот метод специально разработан для исследования нуклеиновых кислот. Заключается в том, что из анализируемого растения выделяют ДНК, которую помещают в специальные пробирки и туда добавляют два синтетических олиго-нуклеотида — праймера размером около 20 нуклеотидов. Каждый из них комплементарен одному из З'-концов фрагмента ДНК. ДНК нагревают (денатурируют) для разделения цепей двойной спирали, а при охлаждении происходит гибридизация праймеров с комплементарными участками фрагментов ДНК. В результате в растворе будут находиться однонитевые ДНК с короткими двухцепочечными участками — затравками (праймерами). При добавлении нуклеотидов и ДНК-полимеразы синтезируются комплементарные цепи и образуются идентичные фрагменты ДНК (первый цикл). Реакция останавливается и ДНК снова денатурируется прогреванием. В процессе охлаждения праймеры, находящиеся в избытке, вновь эффективно гибридизуются, но уже не только с цепями исходной ДНК, но и с вновь синтезированными. Внесение в систему ДНК-полимеразы инициирует второй цикл полимеразной реакции. Многократное повторение описанной процедуры позволяет провести 30 и более циклов ферментативного удлинения праймеров. При этом число сегментов ДНК, ограниченных с обоих концов используемыми праймерами, с каждым циклом ПЦР увеличивается экспоненциально (приближается к зависимости 2п, где п — число циклов). Выход всех других продуктов реакции увеличивается по линейной зависимости. Таким образом, в процессе рассматриваемой реакции эффективно амплифицируется только та последовательность ДНК, которая ограничена праймерами. Получаемый сегмент ДНК выявляется в виде дискретной полосы после электрофоретического разделения молекул ДНК и окраски их специальным красителем для ДНК — этидиум бромидом.

 
ДНК-гибридизация (Саузерн-блоттинг — Southern-blotting) — это также метод  исследования ДНК. При использовании  этого метода можно доказать не только то, что искомая последовательность ДНК присутствует в геноме, но и число встроенных копий этой последовательности. Исследуемую ДНК разрезают на фрагменты с помощью специальных ферментов рестриктаз, разделяют с помощью электрофореза, подвергают денатурации и фиксируют на твердой подложке, например, на нитроцеллюлозном или найлоновом фильтре. Меченый (радиоактивно или флуоресцентно) ДНК-зонд (обычно длиной от 100 до 1000 п.н.) также денатурируют, наносят на фильтр с исследуемой ДНК и гибридизуют с полученными фрагментами ДНК. Для удаления негибридизовавшегося ДНК-зонда фильтр промывают и визуализируют метку. Если гибридизация между зондом и исследуемой ДНК не произошла, то никакой метки на фильтре не обнаруживается, т.е. встраивания чужеродной ДНК не произошло.

 
НАСЛЕДОВАНИЕ ТРАНСГЕНОВ

Наследуемость встроенного гена наряду с доказательствами с помощью молекулярных методов  является доказательством трансгенности  полученных после трансформации  растений. Присутствие введенного гена у потомков изучают теми же методами, которыми первоначально доказывают трансгенность полученных растений:  
а) определяя наличие гена в геномной ДНК трансгенного организма (ПЦР и Саузерн);  
б) оценивая уровень транскрипции введенного гена методом обратной транскрипции (ОТ-ПЦР), который заключается в том, что из растений выделяют РНК, на которой с помощью фермента, называемого ревертазой, синтезируют ДНК (к-ДНК), затем ставят обычную реакцию ПЦР; в) контролируя экспрессию гена по конечному белковому продукту или по тому эффекту, который этот белок вызывает.  

Использование разных методов для доказательства истинной трансгенности данного  растения необходимо для того, чтобы  исключить «псевдотрансгенные»  черты, вызванные сомаклональной (эпигенетической) изменчивостью, химерностью или неполным удалением агробактерий.

 
Чужеродные ДНК, перенесенные в растительные клетки с помощью различных методов, обычно встраиваются в ядерный геном  и, как правило, наследуются в  соответствии с законами Менделя. Если трансгены в потомстве самоопыленных трансгенных растений наследуются как единый менделевский признак, сегрегируя в отношении 3:1, то это говорит о том, что вставка гена произошла в отдельный хромосомный сайт, то есть чужеродная ДНК в высших растениях, по-видимому, локализована как любая эндогенная мутация, даже если место встраивания Т-ДНК у разных трансформированных клеток не совпадает (встройка произошла в различные участки одной и той же хромосомы или в разные хромосомы или в несколько различных локусов). В случае проведения перекрестного опыления с нетрансформированным растением наследование трансгена должно быть в соотношении 1:1. В некоторых случаях наследуемый ген может распределяться в потомстве самоопыленных растений с другой частотой, например, 15:1 (в случае 2-х вставок).

 
При проведении опытов по трансформации  растений, необходимо принимать во внимание тот факт, что чужеродная ДНК может подвергаться различным  модификациям перед встраиванием в  геном хозяина. Однако и после  интеграции могут происходить различные  ее перестройки, обычно во время мейоза, ингибируя экспрессию встроенных генов. В таких случаях только перекрестное опыление тщательно отобранных трансформантов с наиболее желательным генотипом и фенотипом дает потомство с предсказуемыми признаками. Тем не менее, в некоторых случаях при проведении перекрестного опыления с нетрансгенными растениями (анализирующее скрещивание) образования семян может не происходить или они могут образовываться в очень маленьком количестве.

 
После того, как получено несколько  поколений трансформированных растений и показано, что встроенные гены наследуются и экспрессируются в них постоянно, полученные растения обязательно должны быть проверены на биобезопасность.

 
У полученных трансгенных растений кроме заданного измененного  признака, зависящего от вставленного целевого гена, совершенно не должны быть изменены его свойства, зависящие от используемого для трансформации генотипа. Надо понимать, что с помощью генетической инженерии не создают совершенно новые растения, а только «улучшают» уже адаптированные к определенным условиям внешней среды и к технологиям возделывания сорта и гибриды. Перед изменением растений обязательно продумывается комплексная селекционно-агротехническая программа, в которой определяются цели и этапы использования классических и биоинженерных методов управления наследственной изменчивостью при использовании того или иного сорта (гибрида) трансформируемого растения. Можно, однако, ожидать, что получаемые в результате трансформации ГМО не будут обладать желаемыми свойствами, или же возникнут какие-то дополнительные свойства, полезность или вредность которых надо еще дополнительно выяснять.

 
Получив трансгенное растение, в  первую очередь оценивают его  эквивалентность с традиционным аналогом, т.е. нетрансфор-мированным растением — не появились ли после трансформации какие-то отличия. Не должны меняться ни морфология созданного ГМ организма, ни его внутренние свойства, ни химический состав продуктов, которые образуются растением. Продукты, образуемые ГМ организмом, должны быть как композиционно, так и по составу абсолютно аналогичны продуцируемым традиционным аналогом. В обязательном порядке необходимо проверить, не приобрели ли вновь созданные ГМ организмы способность продуцировать токсичные, аллергенные, тератогенные или иные опасные и/или нежелательные вещества, препятствующие использованию полученных из них продуктов в пищевых или кормовых целях.

 
Необходимо все растения, которые  получают методом трансформации, тщательно  анализировать по всем признакам, чтобы  быть уверенными, что введенная конструкция, содержащая чужеродный целевой ген, ничего не нарушила в геноме хозяина, что нет никаких фенотипических и нежелательных физиолого-биохимических изменений. Только после комплексных многосторонних исследований полученные трансгенные растения, обладающие новыми полезными для человека свойствами, могут быть размножены и использованы в производстве различных продуктов, особенно продуктов питания человека и животных.

ПОЛУЧЕННЫЕ К  НАСТОЯЩЕМУ ВРЕМЕНИ ТРАНСГЕННЫЕ  РАСТЕНИЯ

К настоящему времени над созданием трансгенных растений работают многие группы учёных. Большинство ГМО получают ля исследовательских целей, например, для изучения биохимии и генетики организмов, вставляя новые гены или выключая имеющиеся. Но основное, что интересует многие фирмы и группы исследователей — это возможность создания трансгенных организмов, обладающих наряду с устойчивостью к гербицидам и вредителям улучшенными питательными или лекарственными свойствами, которые превосходили бы традиционные сорта. Существует множество примеров этого. Почти каждый день в прессе появляются новые сообщения. Мы приводим в данной статье только некоторые, наиболее интересные на настоящий момент примеры.

 
Так, например, в США поступило  в продажу соевое масло с низким содержанием линоленовой кислоты; в Австралии создан сорт кресс-салата, обогащенный полиненасыщенными омега-3 жирными кислотами, которые снижают риск сердечно-сосудистых заболеваний; выведены ГМ-сорта томатов с вакциной против атипичной пневмонии; картофеля, снижающего риск заражения гепатитом В, а также риса с вакциной от аллергических реакций типа сенной лихорадки; в Японии создан ГМ-сорт сои, обогащенной новокинином (в природе содержится преимущественно в яичном белке), который улучшает рост волос и замедляет их выпадение при химиотерапии за счет синтеза новых кровеносных сосудов и улучшения микроциркуляции в коже головы.

 
Растения могут быть также использованы в качестве источника биотоплива. В настоящее время наиболее распространенным видом биотоплива для транспортных средств является этиловый спирт, который получают путем ферментативной переработки пшеничной и кукурузной соломы, а также сельскохозяйственных отходов, в основном состоящих из целлюлозы, гемицеллюлоз и лигнина, а также других компонентов клеточных стенок. Из этих растительных остатков путем ферментативной обработки получают спирт, химически идентичный спирту, полученному из пшеницы или сахара, но более дешевый. При увеличении размера клеток растений в процессе их роста естественно будут увеличиваться и их клеточные стенки. Ученые из университета Пердью (Purdue University) под руководством Дэна Шиманского (Dan Szymanski) на модельном растении из семейства капустных — Arabidopsis изучили функцию белка, регулирующего гены ферментов, участвующих в синтезе клеточной стенки. При встраивании гена этого белка в другие растения, образующие большую растительную массу (например, кукурузу), можно изменить размер и форму клетки, увеличив число целлюлозных молекул, то есть, значительно увеличить количество сырья, необходимого для производства биотоплива.

Кроме того, в  настоящее время производят трансгенные  растения не столько для питания, сколько для технических целей, например, для фиторемедиации почв, т.е. очищения загрязненных территорий с помощью растений, которые способны через корни поглощать различные соединения, расщеплять их и либо использовать для построения организма, либо накапливать без вреда для себя. Основная связанная с этим проблема заключается в том, что процесс очищения протекает очень медленно и полностью останавливается в зимний период. Поэтому во многих случаях использование растений для фиторемедиации не имеет практического смысла, т.к. регулирующие органы устанавливают достаточно жесткие сроки очищения загрязненных территорий. Сейчас для очистки почв применяют химические средства дезактивации или срезают верхний слой, проводя захоронение его в специальных местах. Однако можно заставить растения поглощать из почвы эти соединения, очищая её. Так, профессор биологии Норман Терри (Norman Terry) из алифорнийского университета в Беркли (University of California, Berkeley) с помощью генной инженерии более чем в пять раз увеличил способность растений индийской горчицы поглощать из почвы селен. Растение преобразовывало селен в безопасное летучее соединение, которое через листья выделялось в воздух. Терри полагает, что генетически модифицированные растения решат эту проблему намного дешевле всех прежних способов. Сейчас многие компании работают над тем, чтобы растения поглощали из почвы ртуть, медь и другие токсичные «тяжелые металлы».