Кормовые добавки биотехнологического генеза

 Протопласты, имеющие только  эластичную цитоплазматическую мембрану, сохраняют целостность и жизнеспособность в гипертонических средах, где они приобретают сферическую форму. В гипотонических растворах, например в дистиллированной воде, происходит лизис протопластов, и это является одним из показателей их образования. Поэтому получение протопластов и все манипуляции с ними проводят в присутствии осмотических стабилизаторов, которые добавляют в концентрациях (0,2 – 0,5 моль), компенсирующих внутриклеточное давление. В качестве осмотических стабилизаторов используют минеральные соли (КС1, NaС1, NH₄Сl, NaNО₃), соли органических кислот (сукцинат натрия), многоатомные спирты (маннитол, сорбитол), углеводы (сахароза, рамноза, ксилоза и др.). Природа и концентрация осмотического стабилизатора могут влиять как на эффективность образования протопластов, так и на их стабильность. Например, протопластирование коринебактерий, проводят в среде, содержащей 0,41 М сахарозы. При более низких и более высоких концентрациях выход протопластов и их жизнеспособность снижаются[2]. Кроме того, образование и сохранение протопластов зависят от температуры и рН среды, концентрации литического фермента и времени инкубирования с ним, возраста (фазы роста) протопластируемой культуры. Так, очень хорошо протопластируются старые культуры пенициллов и плохо – старые бактериальные культуры.

Использование протопластов в генетических экспериментах стало возможным после того, как было обнаружено, что эффективным индуктором их слияния является полиэтиленгликоль (ПЭГ) – хорошо растворимый в воде полимер. Поверхность клеток и протопластов заряжена отрицательно и окружена водным слоем. Эти факторы препятствуют контакту и слиянию мембран. Действие ПЭГ сводится к тому, что он, по-видимому, снижает поверхностный заряд протопластов и отбирает у них воду. Тем самым создаются условия для тесного контакта и слипания мембран. В местах слипания происходит разрыв мембран и содержимое двух соседних протопластов объединяется. Образующиеся структуры сохраняют способность к восстановлению клеточной стенки. В результате появляются гибридные клетки.

клетка       протопласт       клетка

Рис. 2. Схема слияния протопластов

Следует указать на ряд особенностей метода слияния протопластов как способа генетического обмена. В отличие от конъюгации, трансдукиии и трансформации у бактерий, при которых в реципиентную клетку попадает лишь часть наследственного материала донора, при слиянии протопластов объединяются и взаимодействуют целые геномы, а также все компоненты цитоплазм родительских клеток. Кроме того, в акте слияния может участвовать более двух протопластов разных штаммов и в результате сразу появляются рекомбинанты, наследующие признаки трех (и более) родителей.

К настоящему времени способы получения  и слияния протопластов описаны для многих десятков видов бактерий, актиномицетов, грибов и дрожжей. Как уже отмечалось, с помощью этого метода можно получать гибридные формы у тех видов микроорганизмов, у которых не обнаружены природные механизмы обмена наследственной информацией, но которые имеют важное значение для микробиологической промышленности.

Таким образом, универсальность, относительная простота и доступность метода слияния протопластов делают особенно полезным его применение в селекции промышленных микроорганизмов. Метод слияния протопластов позволяет объединять в одном геноме мутации, положительно влияющие на продуктивность и полученные в разных селекционных линиях, в том числе такие, которые трудно или даже невозможно последовательно индуцировать в одной и той же клетке, а также избавляться от вредных мутаций, снижающих жизнеспособность штаммов-продуцентов. Во многих отношениях этот метод является более эффективным, чем все другие способы обмена наследственной информацией[4]. Так, при слиянии протопластов актиномииетов частота образования рекомбинантов на 3–4 порядка превосходит вероятность их появления при конъюгации и иногда приближается к 100%. В этих условиях не требуются специальных приемов для контрселекции родительских штаммов. Кроме того, для применения протопластов практически нет никаких ограничений, в то время как конъюгация наблюдается только у отдельных видов. Все это делает метод слияния протопластов очень перспективным для селекционной работы с актиномицетами, которые являются продуцентами многих важных антибиотиков. Появились сообщения о том, что с помощью этого метода сконструированы эффективные штаммы-продуценты, например штамм Strерtотусes lасtатdurапs, обладающий повышенной способностью к продукции цефамицина С.

Интересно, что в некоторых случаях  повышение уровня синтеза антибиотиков происходит уже в результате одного или нескольких циклов протопластирования – регенерации протопластов штамма-продуцента. Так, штамм Strерtотусes  fradiae, синтезирующий тилозин, после двух раундов такой обработки втрое увеличил свою продуктивность. Причины этого явления пока не исследованы.

Раздел 2. Иммобилизация ферментов путем поперечных сшивок

Широкие перспективы открылись перед инженерной энзимологией в результате создания нового типа биоорганических катализаторов, так называемых иммобилизованных ферментов. Иммобилизация – это процесс прикрепления ферментов к поверхности природных или синтетических материалов, включение их в полимерные материалы, полые волокна и мембранные капсулы, поперечная химическая сшивка[3]. Иммобилизацию также можно характеризовать как физическое разделение катализатора и растворителя, в ходе которого молекулы субстрата и продукта легко обмениваются между фазами.

При иммобилизации ферментов происходит стабилизация каталитической активности, так как этот процесс препятствует денатурации белков. Иммобилизованный фермент, имеющий ограниченную возможность для конформационных перестроек, быстрее растворимого находит кратчайший путь к функционально активной конформации. Иммобилизованные ферменты приобретают, помимо стабильности, отдельные свойства, не характерные для их свободного состояния, например, возможность функционировать в неводной среде, более широкие зоны оптимума по температуре и рН. 

Длительность сохранения каталитической активности и ряд свойств ферментов определяются правильностью выбора носителя, метода и условий проведения иммобилизации.

Существуют  два принципиально различных метода иммобилизации ферментов: без возникновения ковалентных связей между ферментом и носителем (физические методы иммобилизации) и с образованием ковалентной связи между ними (химические методы иммобилизации).

Рис.3. Методы иммобилизации ферментов (Ф -молекула фермента)

 Каждый из этих методов осуществляется разными способами.

Физические  методы иммобилизации ферментов реализуются посредством адсорбции фермента на нерастворимом носителе, путем включения энзимов в поры поперечносшитого геля, в полупроницаемые структуры или двухфазные системы.

Адсорбция ферментов на нерастворимых  носителях. При адсорбционной иммобилизации белковая молекула удерживается на поверхности носителя за счет электростатических, гидрофобных, дисперсионных взаимодействий и водородных связей. Адсорбция была первым методом иммобилизации ферментов (Дж. Нельсон, Э.Гриффин, 1916), но и сейчас не потеряла своего значения и стала наиболее широко распространенным способом получения иммобилизованных ферментов в промышленности. В литературе описано получение адсорбционным способом более 70 иммобилизованных ферментов с использованием главным образом таких носителей, как кремнезем, активированный уголь, графитовая сажа, различные глины, пористое стекло, полисахариды, синтетические полимеры, оксиды алюминия, титана и других металлов[5]. Последние применяются наиболее часто. Эффективность адсорбции молекулы белка на носителе определяется удельной поверхностью (плотностью центров сорбции) и пористостью носителя. Процесс адсорбции ферментов на нерастворимых носителях отличается крайней простотой и достигается при контакте водного раствора фермента с носителем (статистическим способом, при перемешивании, динамическим способом с использованием колонок). С этой целью раствор фермента смешивают со свежим осадком, например, гидроксида титана, и высушивают в мягких условиях. Активность фермента при таком варианте иммобилизации сохраняется практически на 100 %, а удельная концентрация белка достигает 64 мг на 1 г носителя.

 К  недостаткам адсорбционного метода  следует отнести невысокую прочность  связывания фермента с носителем. При изменении условий иммобилизации могут происходить десорбция фермента, его потеря и загрязнение продуктов реакции. Существенно повысить прочность связывания фермента с носителем может предварительная его модификация (обработка ионами металлов, полифункциональными агентами - полимерами, белками, гидрофобными соединениями, монослоем липида и пр.). Иногда, наоборот, модификации подвергается молекула исходного фермента, однако зачастую это ведет к снижению его активности.

Иммобилизация ферментов путем  включения в гель. Способ иммобилизации ферментов путем включения в трехмерную структуру полимерного геля широко распространен благодаря своей простоте и уникальности. Метод применим для иммобилизации не только индивидуальных ферментов, но и мультиэнзимных комплексов и даже интактных клеток[4]. Иммобилизацию ферментов в геле осуществляют двумя способами. В первом случае фермент вводят в водный раствор мономера, а затем проводят полимеризацию, в результате которой возникает пространственная структура полимерного геля с включенными в его ячейки молекулами фермента. Во втором случае фермент вносят в раствор уже готового полимера, который впоследствии переводят в гелеобразное состояние. Для первого варианта используют гели полиакриламида, поливинилового спирта, поливинилпирролидона, силикагеля, для второго - гели крахмала, агар-агара, каррагинана, агарозы, фосфата кальция.

 Иммобилизация  ферментов в гелях обеспечивает  равномерное распределение энзима  в объеме носителя. Большинство  гелевых матриц обладает высокой механической, химической, тепловой и биологической стойкостью и обеспечивает возможность многократного использования фермента, включенного в его структуру. Однако метод непригоден для иммобилизации ферментов, действующих на водонерастворимые субстраты.

Иммобилизация ферментов в полупроницаемые  структуры. Сущность этого способа иммобилизации заключается в отделении водного раствора фермента от водного раствора субстрата с помощью полупроницаемой мембраны, пропускающей низкомолекулярные молекулы субстратов и кофакторов, но задерживающей большие молекулы фермента. Разработано несколько модификаций этого метода, из которых интерес представляет микрокапсулирование и включение ферментов в липосомы.

 Первый  способ предложен Т.Чангом в 1964 г. и состоит в том, что водный раствор фермента включается внутрь замкнутой микрокапсулы, стенки которой образованы полупроницаемым полимером. Один из механизмов возникновения мембраны на поверхности водных микрокапсул фермента заключается в реакции межфазной поликонденсации двух соединений, одно из которых растворено в водной, а другое – в органической фазе. Размер получаемых капсул составляет десятки или сотни микрометров, а толщина мембраны – сотые доли микрометра.

 Достоинства  метода микрокапсулирования – простота, универсальность, возможность многократного использования нативного фермента (фермент может быть отделен от непрореагировавшего субстрата и продуктов реакции процедурой простого фильтрования). Особенно существенно, что методом микрокапсулирования могут быть иммобилизованы не только индивидуальные ферменты, но и мультиэнзимные комплексы, целые клетки и отдельные фрагменты клеток[5]. К недостаткам метода следует отнести невозможность инкапсулированных ферментов осуществлять превращения высокомолекулярных субстратов.

 Близким  к инкапсулированию методом иммобилизации можно считать включение водных растворов ферментов в липосомы, представляющие собой сферические или ламеллярные системы двойных липидных бислоев. Впервые данный способ был применен для иммобилизации ферментов Дж. Вайсманом и Дж. Сессом в 1970 г. Для получения липосом из растворов липида (чаще всего лецитина) упаривают органический растворитель. Оставшуюся тонкую пленку липидов диспергируют в водном растворе, содержащем фермент. В процессе диспергирования происходит самосборка бислойных липидных структур липосомы, содержащих включенный раствор фермента.

 Ферменты, иммобилизованные путем включения  в структуру липосом, используют преимущественно в медицинских и научных целях, ибо значительная часть ферментов в клетке локализована в составе липидного матрикса биологических мембран, поэтому изучение липосом имеет большое значение для понимания закономерностей процессов жизнедеятельности в клетке.

 Химические методы иммобилизации  ферментов. Иммобилизация ферментов путем образования новых ковалентных связей между ферментом и носителем - наиболее массовый способ получения промышленных биокатализаторов.

 В  отличие от физических методов  этот способ иммобилизации обеспечивает  прочную и необратимую связь  фермента с носителем и часто  сопровождается стабилизацией молекулы  энзима. Однако расположение фермента  относительно носителя на расстоянии  одной ковалентной связи создает  стерические трудности в осуществлении каталитического процесса. Фермент отделяют от носителя с помощью вставки (сшивка, спейсер), в роли которой чаще всего выступают бифункциональные и полифункциональные агенты (бромциан, гидразин, сульфурилхлорид, глутаровый диальдегид и др.). Например, для выведения галактозилтрансферазы из микроокружения носителя между ним и ферментом вставляют последовательность —СН₂—NH—(СН₂)₅—СО— . В этом случае структура иммобилизованного фермента включает носитель, вставку и фермент, соединенные между собой ковалентными связями.