Вирус чумы крупного рогатого скота

5.1. Выделение вируса.

Сущность метода заключается в выявлении патогенного действия вируса на эмбрионы кур, его гемагглютинирующих свойств с последующей идентификацией серологическим методом, определении титра и вирулентности выделенного вируса.Для определения антител в сыворотке крови берут стерильно в пробирки, увлажненные физиологическим раствором, пробы крови из подкрыльцовой вены птиц. Полученную кровь выдерживают до образования сгустка при комнатной температуре или в термостате при 37 С в течение 1-2 ч, затем осторожно обводят иглой или пастеризованной пипеткой и оставляют на 16 часов в рефрижераторе при температуре 2-4 С.Образовавшуюся прозрачную без гемолиза сыворотку отсасывают пипеткой в стерильные пробирки.

С целью ретроспективной диагностики пробы крови берут через 12-14 суток после первых признаков клинического проявления болезни.

5.2Метод выделения вируса.

Сущность метода заключается в выявлении патогенного действия вируса на эмбрионы кур, его гемагглютинирующих свойств с последующей идентификацией серологическим методом, определении титра и вирулентности выделенного вируса.

Проведение исследования. Надосадочную жидкость исследуют в капельной реакции гемагглютинации с 1%-ной суспензией эритроцитов кур. Для исследования одной пробы материала заражают не менее 10 эмбрионов 9-10-суточного возраста. Контролем служат 3-5 незараженных эмбрионов.Перед заражением эмбрионы предварительно овоскопируют, отмечая границу дуги. Сбоку эмбриона между кровеносными сосудами отмечают участок для прокола скорлупы и инокуляции испытуемого материала. Скорлупу со стороны дуги и место прокола дезинфицируют и обрабатывают фламбированием. В центре воздушного пространства и в месте введения материала делают пробойником отверстия, затем через боковое отверстие вводят 0,2 см3 испытуемого материала на глубину 2-3 мм в аллантоисную полость. После заражения эмбрионов отверстия в скорлупе заливают парафином. Зараженные и контрольные эмбрионы инкубируют в термостате в течение 120 часов при температуре 37 С. В процессе инкубации эмбрионы овоскопируют 2 раза в сутки через 12 часов. Эмбрионы, погибшие в течение первых 24 часов, уничтожают, остальные сохраняют в холодильние при температуре 4 С. Через 72 часа инкубации пять эмбрионов охлаждают при температуре 4 С в течение 12-18 часов, остальные пять инкубируют до 120 часов, а затем охлаждают при 4 С в течение 16-18 часов. Перед вскрытием эмбрионов скорлупу над воздушным пространством дезинфицируют 5%-ным раствором йода или фламбируют и собирают экстраэмбриональную (аллантоисно-амниотическую) жидкость в стерильные пробирки от каждого эмбриона отдельно. Велогенные штаммы вируса убивают куриные эмбрионы через 32-60 часов инкубации, мезогенные – через 60-90 ч, лентогенные – через 100 часов и более.

Взятые из каждого эмбриона образцы экстраэмбриональной жидкости проверяют на гемагглютинирующую активность вируса в капельной реакции гамагглютинации (РГА), которую ставят на стекле путем смешивания капли экстраэмбриональной жидкости с каплей 1%-ной взвеси эритроцитов кур.При отсутствии РГА экстраэмбриональную жидкость, взятую в количестве 1 см3 от каждого зараженного эмбриона ( не менее 5), соединяют и повоторно заражают развивающиеся куриные эмбрионы 9-10-суточного возраста ( не менее 10 эмбрионов). Выделение вируса проводят в течение 3-5 пассажей на куриных эмбрионах, проверяя в каждом пассаже экстраэмбриональную жидкость на наличие гемагглютининов в капельной РГА. Если титры гемагглютининов низкие, проводят еще 2-3 дополнительных пассажа.

Обработка результатов: пробу испытуемого материала считают отрицательной, если во всех проведенных пассажах не будут обнаружены гемагглютинация эритроцитов и патогенное действие вируса (гибель эмбрионов).

5.3. Метод постановки реакции  гемагглютинации.

Сущность метода заключается в способности вируса болезни Ньюкасла агглютинировать эритроциты кур.

Проведение исследования: Готовят двукратные разведения вируссодержащего материала от 1:2 до 1:1024. Для этого в ряд лунок планшетки из плексигласа ( или пробирок) наливают физиологический раствор в объеме 0,2 см3. Затем в первую лунку вносят 0,2 см3 вируса, трехкратно пипетируют и переносят 0,2 см3 смеси во вторую лунку и т.д. до требуемого разведения. Из последней лунки 0,2 см3 смеси удаляют в дезинфицирующий раствор ( 1%-ный раствор гидроокиси натрия). В каждую лунку добавляют по 0,2 см3 1%-ной суспензии куриных эритроцитов. Планшеты с лунками встряхивают и оставляют при комнатной температуре на 30 минут. Контролем реакции служат 2 лунки с эритроцитами и физиологическим раствором в равных объемах, по 0,2 см3 каждого. РГА также можно ставить микротитратором Такачи в объеме 0,025 см3 в планшетах с лунками.

Обработка результатов. Образование на дне и стенках лунок осадка эритроцитов в виде опрокинутого «зонтика» свидетельствует о положительной РГА.

Отрицательная РГА – образование на дне лунок диска с ровными краями («пуговка»). Такой же результат дают и контрольные лунки.

5.4. Метод идентификации  вируса

Сущность метода заключается в способности специфических антител нейтрализовать гемагглютинирующею способность сируса в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) с эталонными специфическими сыворотками к вирусу болезни Ньюкасла и типировании антител в сыворотке крови больных. Переболевших или подозреваемых в заболевании птиц с эталонными диагностическими антигенами вируса болезни Ньюкасла. Для дифференцировки в реакцию вводят сыворотку против вируса гриппа птиц.

Для постановки основного опыта в ряд лунок, начиная со второй, наливают по 0,2 см3 физиологического раствора. Затем в первую и вторую лунки добавляют по 0,2 см3 приготовленной специфической сыворотки. Во второй лунке пипетируют и переносят 0,2 см3 смеси в третью лунку и т.д. до требуемого разведения. После этого во все лунки вносят по 0,2 см3 рабочего разведения вируса (4АЕ). Доски встряхивают и после 30 минут контакта сыворотки с вирусом в каждую лунку добавляют по 0,4 см3 1%-ной суспензии эритроцитов.

Учет результатов проводят визуально через 20-30 минут после оседания эритроцитов в контроле.

Обработка результатов. РТГА считают положительной, если специфическая сыворотка к вирусу болезни Ньюкасла полностью тормозит гемагглютинирующую активность вируса (испытуемого штамма) не менее ¼ до 1/8 ее гомологического титра.

5.5. Метод титрования вируса

Сущность метода в определении титра вируса на эмбрионах кур.

Вычисление ЛД50 для куриных эмбрионов проводят по методу Рида и Менча.

5.6. Метод определения вирулентности вируса.

Минимальной летальной дозой (МЛД) считают самое большое разведение, вызывающее гибель всех инокулированных эмбрионов. Среднее время гибели (СВГ) вычисляют делением суммы часов гибели всех эмбрионов, вызванных минимальной летальной дозой, на число эмбрионов. У велогенных штаммов СВГ составляет до 60 часов, у мезогенных – от 60 до 90 ч, а у лентогенных штаммов – более 100 часов.

5.7. Метод определения специфических антител.

Сущность заключается в обнаружении специфической способности антител сыворотки крови больных и переболевших птиц подавлять гемагглютинирующее действие вируса в реакции торможения гемагглютинации (РТГА).

Титром сыворотки считают последнее её разведение, которое дает полную задержку гемагглютинации с заведомо известным антигеном. Выявление титров 1:4 и выше у отдельных экземпляров птицы дает основание для проведения вирусологических исследований, т.е. выделения и идентификации вируса. Выделенный и типизированный со специфическими сыворотками вирус служит основанием для постановки диагноза.

Серодиагностика и ретроспективная диагностика ньюкаслской болезни основана на выявлении специфических антител к возбудителю болезни . В практике используют РТГА , в которой исследуют парные пробы сыворотки крови в присутствии эталонного антигена. 

Дифференциальная диагностика. Проводится по данным исследования вируссодержащего материала (гибридизационным тестом, биопробой, серологическими реакциями с видоспецифической сывороткой).  
 
 
 

6. Специфическая профилактика.

Естественно переболевшая или вакцинированная птица приобретает иммунитет, продолжительность и напряженность которого зависит от возраста птицы, биологических свойств вируса и метода введения его в организм. Для специфической профилактики применяют инактивированные и живые вакцины. Количество первых последнее время значительно сокращалось. Однако односторонняя ориентация на живые вакцины разной степени аттенуации и в ряде случаев нежелательные последствия их применения вынудили исследователей и практических специалистов вновь вернуться к инактивированным препаратам, правда, более современным.

Применение живых вакцин

 Ассортимент живых вакцин, применяемых в 
настоящее время весьма широк: Н, В, F, FR, Комаров, Roakin, Ла Сота, Банковский, Муктесвар, Миннесот, Бургас, Нью-Джерси, Нью-Йорк, Накарелла, К,ГАМ, V4 и др. Среди вакцинных лентогенных штаммов вируса НБ известны - В, NDP,LZ58 и Clone 30, Ulster 2C.В 1989 г.в Австралии выделен шт. N4, характеризующийся полной авирулентностью для птицы и активным распространением его среди птиц (высокой контагиозностью). Вирус вызывает иммунитет при введении интраокулярно, внутримышечно и аэрозольно. Он персистирует в организме привитой птицы до 2 лет. У подсаженной не привитой птицы к вакцинированной в течение 80дней. обнаруживались AT. Несмотря на низкие титры (ниже 3 Iog2), привитая птица обладала устойчивостью к заражению вирулентным вирусом, что свидетельствует о развитии местного секреторного или клеточно-опосредованного иммунитета безвысоких титров гуморальных AT. Пероральная вакцинация штамм У4 (Австрия) стимулирует лимфоидные ткани кишечного тракта, что индуцирует секреторные иммуноглобулины и обеспечивает защиту даже при низком уровне циркуляторных гуморальных AT. Шт.V4, заданный с питьевой водой или кормом, после вакцинации выделяется в окружающую среду. По мнению авторов, пероральная вакцинация этим штаммом может разрешить ряд проблем профилактики НБ в небольших фермерских хозяйствах. Пылевидная вакцина из шт. La-Sota разработана во ВНИИВВиМ. В основе технологии изготовления использован метод сушки смеси вируссодержащего материала с наполнителем. Вакцина обеспечивает высокий иммунологический эффект и практически не обладает реактогенностью в широком диапазоне доз, имеет выраженную иммуногенность для цыплят 14-16 недельного возраста в благополучном и стационарно неблагополучном стаде птиц. В ВГНКИ ветпрепаратов проведены исследования по совершенствованию методов контроля иммуногенности вакцин против НБ. Установленный минимальный защитный титр анти-ГА 3 Iog2 и более, давал вполне объективную информацию о иммуногенности вакцины. Для исключения погрешностей в методику была включена референс-вакцина НБ, позволяющая правильно интерпретировать получаемые результаты и более дифференцировано подходить к оценке этого показателя у серийно производимого препарата. Референс-серии готовят во ВГНКИ, контролируют на соответствие заложенным в ТУ параметрам и поставляют на биопредприятия. Новая методика предусматривает 10-кратный запас иммуногенности и обязательное соответствие параметрам референс-серий не менее чем на 80%. Экспериментально определены иммунизирующие дозы (НМД), обеспечивающие абсолютную защиту птицы от 1000 ЛД50 вирулентного вируса (ИМД90), равные для шт. La Sota/ 6,7 lg ЭИД50, для штамма Бор/74 ВГНКИ - 6 lg ЭИД50 при интраназальном применениии 7,7 и 7,0 lg ЭИД50 соответственно при энтеральном применении. Они оказались значительно выше, чем в случаях применения серий вакцин с минимально допустимой по ТУ активностью (8,0 lg ЭИД5о /см3). В связи с этим минимально допустимая инфекционная активность препаратов увеличена до 9 lg ЭИД50 /см3. В СНГ широко применяют сухие вирус-вакцины из штаммов Н, Bl, La Sota, Бор/74/ВГНКИ. В профилактике НБ важна разработка оптимальной схемы иммунизации птицы. Наиболее подходящий возраст для первой вакцинации - 10-14-й день, а для ревакцинации - 5-6 нед. 
Лучшие результаты получены при аэрозольной вакцинации в 10-дн., 5- и8-нед. возрасте. У индюшат осложнения после применения живой вакцины против НБ в2-3 нед. возрасте связывают с подавлением вакцинным вирусом фагоцитарной активности альвеолярных макрофагов. Во избежание этого предложена более рациональная схема иммунизации индюшат. В первый день жизни им вводят подкожно инактивированную вакцину в дозе 0,1 мл, а через 2 недели аэрозольно вакцинируют живой вакциной из штамма В1. Такая вакцинация обеспечивает длительный иммунитет. Высокий уровень поствакцинального иммунитета у матерей не препятствовал иммунизации суточных индюшат инактивированной вакциной. В неблагополучных товарных хозяйствах рекомендуют прививать индеек аэрозольно с интервалом 5 недель в течение всего производственного периода. Преимущество гранулированных форм вакцин из шт. У 4 и Roakin в их более высокой термостабильности; их можно транспортировать без рефрижератора и смешивать с любым обычным кормом. Активность клеточного иммунитета у цыплят, вакцинированных шт. V4 вируса НБ, определяли с помощью теста ингибиции миграции лейкоцитов (ИМЛ). Исследовали роль защитных реакций слизистых оболочек в создании поствакцинального иммунитета. Цыплят вакцинировали 2-кратно с 2-недельным интервалом интраназально, интраокулярно и введением вакцины в зоб. Каждый цыпленок получал дозу 7,8 lg ЭИД50 шт. V4. Через неделю в сыворотке и слезной жидкости цыплят, вакцинированных всеми способами, обнаруживали повышение уровня AT. Оральная вакцинация inr.V4 индуцирует у цыплят не только гуморальные иммунные реакции, но и реакции иммунокомпетентных элементов слизистых оболочек. Показана высокая интерферирующая активность ПМВ-2, что необходимо учитывать при изготовлении эмбриональной вакцины против НБ .Получена живая вакцина из мутанта шт. Hitchner В1 путем клонирования методом бляшек серийными пассажами при температуре 28-30°С.

Н.А. Лагуткин и соавторы рекомендуют выпускать вакцины из шт. Bl, La Sota и Бор/74 ВГНКИ с активностью не ниже 9 lg ЭИД50/мл. и с титром в РГА не ниже 1:128. Доза при интраназальном (окулярном) введении должна быть 2-4 млн. ЭИД50/мл, а при пероральном применении 10-20 млн. ЭИД50/мл с выпаиванием 2 дня подряд.

Э.Ф. Токарик и соавторы рекомендовали свой способ профилактики НБ, суть которого состоит в том, что цыплят в суточном возрасте иммунизируют вакциной из шт. La-Sota вдозе 20-40 ЭИД5о/на голову. После вакцинации цыплятам с кормом вводили пробиотик Авилакт-1К в суточной дозе 0,5 - 1,5% от массы корма 2-мя циклами по 7-15 дн. С перерывом 15-12 дней. Использование пробиотика Авилакт-lK повышал антигенность 
вируса La Sota, усиливал иммунный ответ и устраняет нежелательное действие материнских AT при иммунизации суточных цыплят. Экспериментальное обоснование эффективной дозы вакцины и перевод её дозировки с объёмных единиц в количественные (ЭИД50) проведено во ВНИТИБП. Для цыплят 15-20-сут возраста эффективная защитная доза (защита 80-100%) при интраназальной вакцинации составляет 103-106 ЭИД50 при титрах анти-ГА 1:8-1:512. Для цыплят 5-суточного возраста, имевших материнские AT, эффективная доза составляет 10б,3  ЭИД50. В опытах с использованием для заражения цыплят как 100 ЛД50, так и 2-106 ЛД50 вирулентного штамма вируса НБ показано, что применение вакцины в дозах 1-106-5-106 ЭИД5о обеспечивало защиту как 5, так и 20-сут. цыплят. Динамика накопления анти-ГА и устойчивости птицы следующая: на 4-й день титр анти-ГА составлял 1:8-1:16, степень защиты - 70%; на 6-й день - титр - 1:32, защита -90%; на 8-й день титр - 1:32-1:64, защита 100%; на 14-й день титр - 1:64-1:512,защита - 100%. Максимальное накопление анти-ГА наблюдалось через 30 дней, к 120-му дню титр их снижался до 1:8-1:4. Однако степень защиты через 3 мес. составляла 92-100%, через 5 мес. - 70-85%.Пассивный иммунитет у цыплят имеет прямое отношение к вирусоносительству и вирусовыделению. Так, при заражении пассивно иммунных цыплят патогенным вирусом 68% из них не проявляли признаков болезни в течение 80 дней наблюдения, но выделяли вирус в течение 45дней, а вирусоносительство наблюдалось 54 дня. Этот факт имеет большое эпизоотологическое значение при проведении мероприятий по санации хозяйств от НБ. Во ВНИИВВиМ разработана новая технология ассоциированной вирус-вакцины против ИЛТ и НБ. Она позволяет получать вакцины для аэрогенного применения с активностью 7 lg ЭИД50/см3 по вирусу ИЛТ и 7,2-7,7 lg ЭИД50 /см3по НБ; для интраназального и орального применения - по ИЛТ не ниже 7,0 lgЭИД50 /см3, по НБ не ниже 9,0 lg ЭИД50 /см3. После двукратной вакцинации в оптимальных дозах иммунитет формируется у 85-100% птиц и сохраняется около 6мес. На основе мезогенного шт. ГАМ-61[А(в)ВН], выделенного из эпизоотического и затем аттенуированного в культуре клеток почек теленка и КЭ, разработана новая вакцина. После испытания в лабораторных и камеральных условиях установлено, что штамм обладает высокой иммуногенностью: обеспечивает защиту 97-100% птицы, привитой различными способами; безвреден в 10-и 100-кратной дозе для цыплят моложе 60-дн возраста, кроме того, его можно использовать в хозяйствах с острой эпизоотической ситуацией. Иммунитет наступает через 72-96ч. Высокая эффективность вакцины подтверждена на 8-миллионном поголовье птиц в стационарно неблагополучных хозяйствах Ставропольского и Краснодарского краев. Авторами изучен механизм формирования ранней невосприимчивости экспериментально инфицированных цыплят, привитых вакциной из шт. ГАМ-61. Результаты опытов показали, что в механизме формирования ранней невосприимчивости к вирусу НБ ведущая роль принадлежит факторам клеточного иммунитета. Защитное влияние гуморальных AT проявляется значительно позже, и в течение первых 3-5сут. не в полной мере отражает истинный иммунологический статус организма. Аэрозольная вакцинация эффективна и безопасна только в стадах, благополучных по респираторным заболеваниям вирусной или бактериальной природы. В противном случае она провоцирует проявление ИЛТ, микоплазмоза и других болезней.