Выделение и клонирование генов

Содержание:

1.Выделение  и клонирование генов……………………………………..……1-14

2.Криоконсервация  эмбрионов………………………………………………..15-27

3.Список  литературы………………………………………………………………….….28

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1. Выделение и клонирование генов.

1. Получение  генов.

а) Выделение генов из ДНК: изолированную ДНК подвергают фрагментации. Для этого используют ферменты - рестрикционные эндонуклеазы (рестриктазы), катализирующие расщепление ДНК на участках, имеющих определенные последовательности нуклеотидов (обычно длиной в 4-7 нуклеотидных пар). Расщепление может происходить по середине узнаваемого участка нуклеотидных пар, и тогда обе нити ДНК «разрезаются» на одном уровне. Образующиеся фрагменты имеют двунитевые (тупые) концы. Другие рестриктазы расщепляют нити ДНК со сдвигом, образуется ступенька – одна из нитей ДНК выступает на несколько нуклеотидов. Образуются однонитевые (липкие) концы. Если встречаются два липких фрагмента ДНК, полученных действием одной и той же рестриктазы, то они легко вступают во взаимодействие (по принципу комплементарности):

При необходимости тупые концы могут быть превращены в липкие. Нуклеотидная последовательность с липкими концами может быть присоединена к вектору, предварительно обработанному той же рестриктазой или превращена из линейной молекулы в кольцевую путем сшивания взаимно комплементарных концов.

 

 

Однако данный метод выделения генов из ДНК имеет недостатки:

1) Достаточно  трудно подобрать рестриктазы, позволяющие  вырезать из ДНК именно тот  участок, который соответствует  нужному гену. Наряду с интересующим  геном фрагменты ДНК, как правило, включают лишние нуклеотидные  последовательности, мешающие использованию  гена. Рестриктаза может отщепить  часть нуклеотидной последовательности  гена, в результате ген теряет  функциональную полноценность.

2) Гены эукариот  имеют сложное строение: включают  экзоны и интроны. Первичная РНК, синтезированная на такой ДНК-матрице, подвергается модификации (сплайсингу), в результате участки, соответствующие  интронам, удаляются, а участки, соответствующие  экзонам, соединяясь, образуют зрелую  матричную РНК. Наличие интронов  является препятствием для нормального  функционирования трансплантированных  генов.

3) При обработке  ДНК рестриктазами образуется  смесь фрагментов. Выделить из  нее фрагменты, несущие нужный  ген – сложная задача. Бактериальная  клетка содержит около 5 тыс. генов, а эукариотная клетка – от 10 до 200 тыс. генов.

б) Химико-ферментативный синтез генов. Данный метод является альтернативой «вырезанию» генов с помощью рестриктаз из нативной ДНК. Метод включает химический синтез коротких (8-16-звенных) одноцепочечных фрагментов ДНК (олигонуклеотидов) за счет поэтапного образования эфирных связей между нуклеотидами и сшивку олигонуклеотидов между собой посредством ДНК-лигазы с образованием двухцепочечных полинуклеотидов.

Химико-ферментативный синтез позволяет точно воссоздать минимально необходимую последовательность нуклеотидов.

Кроме того, существует возможность введения в гены участков узнавания различных рестриктаз, регуляторных последовательностей.

Применимость данного метода ограничена возможностями получения информации о нуклеотидной последовательности гена. Эта последовательность может быть воссоздана на основе первичной структуры соответствующего белка.

Методом химико-ферментативного синтеза получены гены соматостатина, А- и В-цепей инсулина, проинсулина и др.

в) Ферментативный синтез генов на основе выделенной из клетки м-РНК. Это наиболее широко распространенный метод синтеза генов. Обратная транскриптаза (ревертаза) катализирует синтез нити ДНК, комплементарной мРНК. Полученную одноцепочечную ДНК (комплементарная ДНК, кДНК) используют в качестве матрицы для синтеза второй нити ДНК с применением ДНК-полимеразы или ревертазы.

Достоинством данного метода является то, что ген получается без интронов и других нетранскрибируемых последовательностей. Кроме того, легче создать условия, когда клетка аккумулирует нужный вид мРНК, чем отбирать ген из смеси фрагментов ДНК.

С помощью этого метода в 1979 г. был получен ген соматотропина (гормона роста человека).

2. Введение  гена в вектор.

Ген, полученный одним из выше описанных способов, содержит информацию о структуре белка, но сам по себе не может реализовать эту информацию. Для этого нужны дополнительные механизмы, управляющие действием, поэтому перенос генетической информации в клетку осуществляется в составе векторов.

Векторы – это, как правило, кольцевые молекулы, способные к самостоятельной репликации. Ген вместе с вектором образует рекомбинантную ДНК.

Конструирование рекомбинантных ДНК осуществляется in vitro. Кольцевая молекула вектора размыкается рестриктазой. Полученная линейная молекула ДНК должна содержать липкие концы, комплементарные концам вводимой ДНК. Комплементарные липкие концы вектора и вводимого гена сшивают ДНК-лигазой и полученную рекомбинантную ДНК с помощью той же ДНК-лигазы вновь замыкают с образованием единой кольцевой молекулы (рис. 1).

Рис.1 Встраивание изолированного гена в генетический вектор

Различают два основных класса векторов: вирусы и плазмиды. При использовании в качестве генетических векторов вирусов возникает проблема – ослабление их патогенности для хозяина.

Большое значение для биотехнологии имеет способность вирусов быстро транспортироваться из клетки в клетку, распространяясь по растительной или животной ткани так, что в короткие сроки развивается генерализованная инфекция по всему организму. Такое свойство вирусов дает возможность генетической модификации соматических клеток взрослого организма, что является перспективным при лечении наследственных заболеваний человека путем введения вирусов, разносящих недостающие гены по всем ~ 1011 клеткам человеческого тела.

Однако наибольшее применение в генетической инженерии нашли бактериальные плазмиды, особенно плазмиды E. coli. Бактериальные плазмиды подразделяются на конъюгативные, т.е. способные к переносу генетической информации от клетки к клетке путем конъюгации бактерий, и неконъюгативные, передающиеся от одной клетки к другой посредством механизма бактериальной трансформации. Некоторые плазмиды способны к амплификации, т.е. образуют в клетке большое число копий, что резко повышает уровень фенотипического выражения генов.

При конструировании векторов в них вводят участки узнавания рестриктаз, а также гены-маркеры, кодирующие легко распознаваемые признаки. По этим признакам отбирают клетки, являющиеся носителями вектора.

В генетической инженерии растений чаще всего используют бактерии родов Rhizobium и Agrobacterium.

3. Перенос  генов в клетки организма-реципиента.

Передача генов, встроенных в плазмиду, осуществляется путем трансформации или конъюгации. Если гены встраиваются в геном вируса, то наиболее распространенным способом передачи информации является трансформация.

Чтобы клетку легко можно было трансформировать она должна быть компетентной. Компетентность бактериальных клеток достигают обработкой СаСl2, полиэтиленгликолем, воздействием теплового удара. ДНК легко проникают в клетку через цитоплазматическую мембрану протопластов. Протопласты бактерий получают при обработке лизоцимом, который гидролизирует мукопептиды клеточной стенки. Протопласты клеток растений и дрожжей получают, разрушая ферментами полисахариды оболочки.

Эффективность трансформации протопластов эукариот увеличивает диэтиламиноэтилдекстран и полиэтиленгликоль. ДНК в клетки высших организмов вводят микроинъекцией.

Трансформация представляет собой наиболее универсальный путь передачи генетической информации, она имеет наибольшее значение для генетической инженерии. Однако существуют еще два способа передачи генетической информации – конъюгация и трансфекция, которые можно рассматривать как варианты трансформации.

При конъюгации происходит перенос лишь некоторых плазмид (конъюгативных). Неконъюгативные плазмиды также могут передаваться путем конъюгации при участии плазмид-помощников.

Трансфекция – передача всего набора генов вируса или фага, приводящая к развитию вирусных частиц в клетке. Трансфекция бактерий включает следующие этапы: получение сферопластов, очистка среды инкубации от внеклеточных нуклеаз и добавление очищенной ДНК фага (с добавлением протаминсульфата, повышающим эффективность трансфекции). Трансфекцию клеток растений и животных осуществляют двумя способами: использованием очищенной ДНК и протопластов, а так же заражением целых многоклеточных организмов (в этом случае говорят об инфекции) вирусными частицами или ДНК. Кроме того, сконструированы многочисленные челночные векторы, способные к репликации в животной и бактериальной клетке и поддерживающие эффективный синтез клонируемого гена в животной клетке.

 

 

4. Идентификация  клеток-реципиентов, которые приобрели  желаемый ген (гены).

После трансформации, конъюгации или трансфекции необходимо идентифицировать клетки, несущие ген-мишень. Успех генноинженерного проекта зависит от эффективности использованного метода отбора, т.к. после трансплантации генов только небольшая часть клеток содержит необходимый ген. Отбор клеток проводят в две стадии.

Первая стадия: отбор клеток, несущих соответствующий вектор. Отбор проводится по генетическим маркерам, которыми помечен вектор.

Например, детерминанты устойчивости к антибиотикам на векторе позволяют обогатить бактериальную популяцию клетками, содержащими этот вектор, при их высеве на среду с антибиотиком.

Вторая стадия: поиск клеток, несущих не только вектор, но и ген-мишень. Для этого используют две группы методов.

1. Методы, основанные на непосредственном  анализе ДНК клеток-реципиентов:

- определение  нуклеотидной последовательности  ДНК: из клеток, предположительно  содержащих искомый ген, выделяют  ДНК вектора, в которой проводится  поиск участков, несущих этот  ген; затем проводят секвенирование  части нуклеотидной последовательности  гена;

- гибридизация  выделенной из клеток ДНК с  зондом, который может быть или  интересующим геном, или соответствующей  ему мРНК. Предварительно изолированную  ДНК переводят в одноцепочечное  состояние и вводят ее во  взаимодействие с одноцепочечным ДНК- (или РНК-) зондом. Далее определяют присутствие двуцепочечных гибридных молекул ДНК.

2. Методы, основанные  на идентификации признака, кодируемого  геном:

- непосредственный  отбор клеток, синтезирующих белок  – продукт транскрипции и трансляции  гена-мишени, или клеток, образующих  соединение, в синтезе которого  участвуют ферменты, кодируемые  геном;

- использование  селективных сред, поддерживающих  рост только тех клеток, которые  получили ген-мишень;

- иммунологическая  детекция применяется, если искомый  ген в составе рекомбинантной  ДНК транскрибируется и транслируется, но никак не влияет на фенотип  организма.

Клонирование генов.

В обычном понимании клоном считается идентичная копия высшего организма, например всемирно известная и ныне покойная овечка Долли. Молекулярные биологи, однако, клоном считают популяцию генетически идентичных (за исключением мутаций, происходящих во время клонирования) организмов, клеток, вирусов или молекул ДНК.

Для получения клона вируса необходимо заразить одну клетку одним вирионом. Все образующиеся вирионы, произведенные зараженной клеткой, будут клонами исходного вириона. Поскольку эти клоны могут заражать новые клетки, то очень быстро можно получить множество копий исходного вириона. Они выглядят как отдельные ясные пятна (бляшки), вызванные гибелью зараженных клеток, на слое (газоне) незараженных клеток в чашке Петри.

Вы можете клонировать клетку, просто выращивая ее на слое ростовой среды (обычно агара — вещества, приготовленного из морских водорослей). Бактериальные клетки, как и клетки млекопитающих, легко клонируются таким образом.

Однако целью клонирования, с точки зрения изучения ДНК, является не получение идентичных копий нормальной клетки, а получение большого количества определенного фрагмента ДНК.

В генетической инженерии цель клонирования, как правило, — получение значительного количества копий специфического гена. Этот ген сообщает клетке функцию, которую вы хотите получить в генетически модифицированном организме.

Прежде чем получить множество копий гена, его нужно сначала отделить от остального генома. Первый шаг на этом пути — создание библиотеки, в которой ДНК генома разбита на куски. Если удача сопутствует вам, то ген, который вы ищете, будет расположен на одном из таких кусков.