Рис. 5. 5. Неоплодотворенная (1) и дегенерированная
(2) яйцеклетки, нормально развитые морула
(3) и бластоциста (4)
Яйцеклетки для культивирования in vitro
получают из яичников коров, убитых на
мясокомбинате, методом рассечения фолликулов
в среде Хенкса с добавлением 1% фетальной
сыворотки, 1 ед/мл гепарина и 5 мкг/мл гентамицина.
Используют морфологический, цитологический
и цитогенетический методы оценки их качества.
Нормально развитые эмбрионы имеют неповрежденные, равномерные
по ширине, опалесцирующие оболочки и
бластомеры в состоянии дробления, соответствующие
возрасту эмбриона. К 5 -7-му дню развития
они обычно достигают стадии морулы (рис
5.5.;3).
Прозрачная зона нормальных морул имеет
форму сферы.
Удваивание
числа бластомеров в морулах происходит
через каждые 24 часа. Различия в степени
дробления эмбрионов в ранний период их
развития могут быть обусловлены растянутостью
сроков овуляции. Бластомеры морул не
обязательно должны иметь одинаковую
величину, что зависит от возможной асинхронности
процесса их деления. На 7-8-й день после
осеменения коров-доноров в промывной
жидкости обнаруживаются бластоцисты.
Нормальная ранняя бластоциста (рис. 5.5;4) имеет
толщину прозрачной оболочки, примерно,
12 мкм, число бластомеров может быть от
80 до 120, просматривается небольшая полость
бластоцисты.
Поверхность
клеточной массы – гладкая, равномерная,
что указывает на наличие соединительного
комплекса между клетками трофобласта,
перивителлиновое пространство маленькое.
Морфологически нормальная поздняя бластоциста
на стадии экспандирования – выхода из
прозрачной оболочки (8,5 дней после осеменения)
характеризуется следующими показателями:
прозрачная оболочка утончена, растянута,
имеет форму правильной сферы; полость
бластоцисты большая; перивителлиновое
пространство отсутствует.
На 9-й день развития прозрачная оболочка
бластоцисты отсутствует, бластополость
сохранена, клетки четко выражены (рис.
5.6;1).
Условно пригодными к пересадке можно
считать эмбрионы с небольшими морфологическими
изменениями (рис. 5.6.2):
1. С невыраженной неравномерностью дробления
бластомеров.
2. Небольшим их сжатием.
3. С включениями в перивителлиновом пространстве.
4. С нарушениями прозрачной оболочки.
Рис. 5.6. Стадии развития и качество эмбрионов
Ооциты
яичников, выбракованных высокопродуктивных
коров могут быть резервом получения эмбрионов
для трансплантации. Для этого необходимо
добиться их созревания в специальной
среде до стадии метафазы II, когда они
окажутся способными к оплодотворению
in vitro.
Ооциты,
выделенные из поверхностных
фолликулов разного размера и
из яичников коров в охоте
окружены слоем фолликулярных
клеток (рис. 5.6; 3).
Овоплазма
морфологически нормальных ооцитов –
это гранулированная масса, равномерно
заполняющая пространство, ограниченное
оболочкой. Нормальная оболочка ооцитов
коров имеет форму равномерного по ширине
прозрачного ободка. К числу морфологических
нарушений оболочки ооцитов следует отнести
потерю прозрачности, деформацию, истончение
или утолщение, надрыв ее или разрыв (рис.
5. 6; 4).
После оценки жизнеспособности ооцит
– кумулюсные комплексы помещают в модифицированную
среду ТС – 199 (Sigma), содержащую 5% эстральной
сыворотки коров, и ставят на культивирование
в СО2 – инкубатор при температуре 38оС; 5% СО2 и 98% - ной влажности. Через 24 часа проводят
оплодотворение. Капацитацию заморожено
– оттаянной спермы осуществляют в модифицированном
растворе Тироде (Sigma) с концентрацией
гепарина 50 мкг/мл.
Совместное
культивирование яйцеклеток и спермиев
осуществляют в течение 18 часов.
После оплодотворения
зиготы помещают в среду для культивирования
ранних эмбрионов, представляющую собой
модификацию среды ТС – 199 (Sigma), на монослой
клеток кумулиса и инкубируют в течение
7-11 дней. Полученные эмбрионы пересаживают
реципиентам. В 1999 году в лаборатории генетики
РУП «НПЦ НАН Беларуси по животноводству»
получены первые в республике телята из
пробирки (in vitro).
Криоконсервацию эмбрионов
используют (или планируют использовать)
для поддержания и разведения
коллекций лабораторных и сельскохозяйственных
животных, сохранения генофонда диких
и исчезающих видов млекопитающих и решения
репродуктивных проблем человека.
Главное преимущество банка
эмбрионов перед банком половых клеток
заключается в том, что эмбрион представляет
собой особь, пусть и состоящую из небольшого
количества клеток. После размораживания
его достаточно пересадить самкам-реципиентам,
чтобы родилось живое потомство. Замораживать
яйцеклетки технически сложнее, чем эмбрионы,
сперматозоиды – проще, но в любом случае
гораздо более хлопотным делом становится
перевод законсервированных клеток в
живую коллекцию, потому что после размораживания,
необходимо еще произвести оплодотворение
Сейчас разработаны
надежные методы хранения эмбрионов,
существует и оборудование для
криобанков. Практика показывает, что
правильно замороженные эмбрионы
могут храниться в жидком азоте
несколько десятилетий, не потеряв
жизнеспособности. Таким образом
можно, например, оптимизировать процесс
разведения сотен тысяч линий
лабораторных мышей и крыс.
Для хранения эмбрионов в криоархиве
требуется несравненно меньше площади
и средств, чем для поддержания той же
линии в питомнике.
Метод криоконсервации
зародышей с успехом применяют
в отношении крупного рогатого
скота, овец и коз, идут работы
по сохранению исчезающего вида
овец – муфлона. Можно, хотя и
с бОльшими сложностями, криоконсервировать
эмбрионы свиньи; с лошадьми это
пока не получается.
Что касается хищников, то получить
живое потомство после замораживания
эмбрионов удалось пока только у домашней
кошки, оцелота и хорька. (Создание криобанка
хорьков – российско-финский проект).
Криоконсервацию успешно
используют и в репродуктивной
медицине, замораживая эмбрионы
человека.
В некоторых случаях
на хранение закладывают ткани
генеративных органов – семенников
и яичников. Этот метод рекомендован
для восстановления плодовитости
у людей, перенесших в раннем
возрасте химио- и лучевую терапию.
После окончания курса лечения
и полного выздоровления пациенту
пересаживают его же собственную
ткань, взятую из криобанка.
Не всегда эмбрионы
консервируют для длительного
хранения. Иногда нужна краткая
консервация, например, для пересылки
из одной страны в другую. Перевозить
замороженные эмбрионы гораздо
проще, чем животных. Кроме того, в ходе
криоконсерванции эмбрионы очищаются
от вирусов, поэтому такую процедуру можно
использовать для очистки линий лабораторных
или сельскохозяйственных животных от
инфекции. Размороженные и отмытые в стерильных
средах эмбрионы пересаживают здоровым
самкам и получают здоровое потомство.
Список литературы:
Сельскохозяйственная биотехнология:
учеб. / В.С. Шевелуха, Е.А. Калашникова,
Е.С. Воронин и др.; под ред. В.С. Шеве- лухи.
2-е изд., перераб. и доп. М.: Высш. шк., 2003.
469 с.
Теппер Е.З. Практикум по микробиологии
/ Е.З. Теппер, В.К. Шильникова, Г.И. Переверзева.
М.: Дрофа, 2004. 256 с.
Биотехнология в животноводстве / В.Ф.
Красота, Б.П. За- вертяев, Е.К. Меркурьева,
А.К. Никитин. М.: Колос, 1994. 127 с.