Выделение и клонирование генов

Библиотека в данном случае ничего общего с книгами не имеет. Скорее, это коллекция фрагментов ДНК, выделенных из одного источника, коллекция клонов.

Для создания библиотеки понадобится вектор. Какая-нибудь молекула ДНК, в которую вы сможете встроить новую ДНК и внести ее в хозяйскую клетку, чтобы она могла реплицировать ее. Самыми распространенными векторами являются плазмиды. Также векторами могут служить фаги .

Выбор вектора для клонирования

Не только вирус или плазмида могут использоваться как векторы. Идеальный вектор для генетической инженерии должен иметь три характеристики.

 

 

 

1. Хороший  потенциал клонирования. То есть  должен давать большое количество  реплик в хозяйской клетке.

2. Его геном  должен иметь один сайт узнавания  для каждого из многих ферментов  рестрикции. Таким образом, чужой  ген сможет встраиваться только  в одну точку вектора.

3. Он должен  иметь полезную функцию в клетке, например нести ген устойчивости  к антибиотику, чтобы можно было  легко отличить клетки, несущие  вектор, и выделить встроенный  в него ген.

ДНК генома из донорского организма разрезается на множество фрагментов ферментами рестрикции, которые также разрезают ДНК-плазмиды в одном месте. Фрагменты геномной ДНК и разрезанной ДНК-плазмиды смешивают. Их липкие концы соединяются друг с другом, в основном, случайно. В результате образуется множество различных плазмид, каждая из которых несет фрагмент донорской ДНК, все они вместе содержат совокупную ДНК генома донора.

Эти плазмиды вводятся в клетки бактерий-реципиентов (клетки становятся проницаемыми для чистой плазмидной ДНК при обработке их холодным раствором хлорида кальция). Трансформированные бактериальные клетки распределяют тонким слоем по агару, так что каждая клетка может размножаться отдельно от остальных.

Плазмида, используемая в качестве вектора, обычно несет гены устойчивости к двум антибиотикам. Исследователи пользуются ферментом рестрикции, чтобы разрезать ДНК плазмиды в одном из этих генов. Любая бактерия, не несущая плазмид, гибнет от каждого из двух антибиотиков. Бактерии, получившие плазмиды без клонированного в них чужого фрагмента ДНК, выживают на агаре с каждым из двух антибиотиков. А вот клетки, несущие плазмиды, в которые встроена чужеродная ДНК, будут расти на агаре только с антибиотиком, ген устойчивости к которому не был разрушен ферментом рестрикции (рис. 2). Эти клетки, у которых чужой ген встроен в ген устойчивости ко второму антибиотику, сформируют колонии, или клоны. Все клетки в каждой колонии будут нести множество копий исходной ДНК, но каждая из них будет также содержать копию нового, чужеродного фрагмента ДНК.

Рис. 2. Использование плазмидного вектора с двумя генами устойчивости к антибиотикам облегчает создание библиотеки

Такая же методика применяется для вирусных или фаговых векторов.

Однажды созданные библиотеки хранятся как постоянный источник ДНК для клонирования (почему, собственно, их и называют библиотеками ).

Библиотеками часто пользуются, чтобы выделить определенные гены. Есть два пути поиска специфических клонов в библиотеке, которые несут фрагменты ДНК с последовательностями нужного гена. Один путь заключается в поиске специфической последовательности оснований этого гена (если она известна).

Другой путь состоит в поиске специфического белка, кодируемого геном. В любом случае, поиск называется скринингом. Есть много методов скрининга, зависящих от используемого вектора и гена, который предстоит найти.

Пример поиска гена, для которого известна последовательность оснований ДНК, приведен на рис. 3.

Рис. 3. Один из методов поиска (скрининга) клонов с определенной последовательностью ДНК

Колонии бактерий или бляшки фага с агара на чашках Петри переносят на твердый диск, обычно из целлюлозы, очень простой методикой. Диск кладут на агар, потом поднимают. Колонии и бляшки остаются на месте, но достаточное для анализа количество материала переносится с них на нитроцеллюлозу диска.

Затем ДНК на диске расплетается за счет помещения его в химический раствор, содержащий однонитевую ДНК или РНК, комплементарные одной из нитей клона и меченные радиоактивными атомами. Меченая нить называется пробой.

В местах соединения пробы с одной из рекомбинантных нитей она оставляет меченые атомы, которые могут регистрироваться на фотографической пленке. Эти места полностью соответствуют местам расположения клонов на агаре в чашке Петри.

Если последовательность ДНК разыскиваемого гена неизвестна, можно использовать другой метод скрининга. Он основан на создании клонов с использованием векторов, позволяющих выражаться генам, которые на них распложены, в новых хозяйских клетках. Клетки начинают продуцировать белок, кодируемый геном, а исследователям остается искать в библиотеке белок нужного гена.

Как только место расположения клона найдено, клон можно снять с агара микробиологической петлей и размножить. Рекомбинантная ДНК легко выделяется из клона и очищается, а клетки клона, продуцирующие ее, длительное время размножаются и хранятся в лаборатории. Все это обеспечивает генным инженерам неограниченное поступление материала нужного гена для его встройки в другие организмы.

 

 

 

 

 

 

Криоконсервация эмбрионов.

Существует два основных способа глубокого замораживания эмбрионов: 
1. Контролируемая медленная (постепенная) криоконсервация; 
2. Несбалансированная криоконсервация с а)ультрабыстрым замораживанием и б)витрификацией. 
Контролируемая медленная криоконсервация является в настоящее время обычным методом консервации эмбрионов. Их охлаждают медленно, чтобы: а) произошло обезвоживание зародыша и уменьшилось образование больших внутриклеточных кристаллов льда; б) жидкость вышла за пределы клеток и более крупные кристаллы льда образовывались только в межклеточном пространстве; в) зародыши оставались в равновесии с замерзающим раствором. При этом если клетки охлаждаются слишком быстро, существует опасность повреждения эмбриона из-за межклеточной и внутриклеточной кристаллизации. Кроме того, растущая концентрация солей в межклеточном растворе может вызвать токсическое повреждение эмбриона. Для такой медленной криоконсервации необходим дорогостоящий импортный замораживатель (стоимостью около 12 тысяч евро), а сам процесс длится два с половиной часа. 
При ультрабыстрых методах замораживания эмбрионы, находящиеся в растворе 3,5-4,5 М ДМСО (диметилсульфоксид) и 0,25-0,5 М сахарозы, помещают в жидкий азот. При этом образующиеся мелкие кристаллы льда, менее стабильные, чем острые крупнокристаллические и тающие при очень низких температурах, не оказывают разрушительного воздействия на тканевую структуру зародыша. 
Под витрификацией понимают переход жидкости в твердое состояние, который вызван не кристаллизацией, а повышением вязкости во время охлаждения.

Витрификационная жидкость состоит из смеси высококонцентрированного (10-25%) проникающего криопротектора (ДМСО, ацетамид, пропиленгликоль, глицерин, этиленгликоль) и непроникающего криопротектора (полиэтиленгликоль, фиколл, сахароза) в буферном солевом растворе. При витрификациизначительно упрощается не только процесс охлаждения, поскольку эмбрионы после кратковременной выдержки в витрификационном растворе сразу погружаются в жидкий азот, но и исключается опасность физических и химических повреждений, вызванных межклеточной и внутриклеточной кристаллизацией воды, к тому же здесь не нужно дорогое компьютеризированное оборудование. Единственным недостатком витрификации является химическая токсичность витрификационных растворов, которая находится в прямой зависимости с концентрацией криопротектора, временем и температурой экспозиции эмбриона в этом растворе. 
Технологические этапы процесса криоконсервации эмбрионов. Использование технологии криоконсервации зародышей позволяет сохранить генетически ценный эмбриоматериал при отсутствии реципиентов, а также проводить трансплантацию эмбрионов в строго определенные сроки с максимальной эффективностью. 
Технология глубокого замораживания и оттаивания эмбрионов предусматривает следующие этапы: 
1. Оценка качества полученных эмбрионов. 
2. Насыщение зародышей криопротектором. 
3. Постепенное охлаждение эмбрионов с помощью программных замораживателей. 
4. Перенос их в жидкий азот на хранение. 
5. Оттаивание эмбрионов при определенной температуре. 
6. Выведение криопротектора из зародышей. 
7. Морфологическая оценка эмбрионов под микроскопом на пригодность к трансплантации. 
8. Заправка эмбриона в пайету и далее в катетер. 
9. Пересадка эмбрионов реципиентам. 
Методика приготовления криопротектора глицерина. В качестве криопротектора для замораживания эмбрионов на стадии развития поздней морулы или ранней бластоцисты и получивших оценку не ниже «хорошо», может использоваться 1,4М раствор глицерина. Методика его приготовления приведена в таблице 5.3. 
 

Таблица 5.3. Методика приготовления раствора глицерина  

 
Насыщение эмбрионов криопротектором осуществляется либо поэтапно в возрастающих концентрациях растворов, либо одноступенчато, как это показано в таблице 5.4. 
Все работы с эмбрионами проводят с использованием стерильной посуды, инструментов и оборудования. После выдержки зародышей в растворе с конечной концентрацией криопротектора соблюдают следующие правила подготовки:  

 

 

 

Таблица 5.4. Схема насыщения эмбрионов криопротекторами

а) эмбрионы с помощью шприца объемом 1 см3 помещают в пайеты, при заправке которых соблюдают следующую последовательность их заполнения (рис. 5.2);

Рис. 5.2. Схема заправки пайеты с эмбрионом

1 - пыж, 2 - защитный  раствор, 3 - пузырек воздуха, 4 - эмбрион, 5 - пайета, 6 - маркировочная пробка 
 
– вначале набирают раствор криопротектора в количестве 2/5 объема; 
– затем пузырек воздуха; 
– снова раствор с эмбрионом (1/5 объема); 
– пузырек воздуха; 
– раствор криопротектора (2/5 объема). 
б) заправка проводится таким образом, чтобы введенный первым объем раствора, постепенно продвигаясь дальше, смочил пыж пайеты; 
в) в одну пайету заправляют не более 2-х эмбрионов; 
г) нижний конец пайеты закрывают пластиковой маркировочной пробкой, на которой указывают дату извлечения эмбриона, номер коровы-донора,

 номер  быка производителя, номер пайеты; 
д) рекомендуется использовать следующие наиболее распространенные иностранные марки программных замораживателей: Миникул АС-25; CryoCell 1200; DB1 EmbryoFreeze. 
Режимы замораживания приведены в инструкциях к замораживающим устройствам. 
Пайеты с эмбрионами переносят в камеру для замораживания и включают программу. Схема прибора для замораживания представлена на рис. 5. 3.

 

 
 
Рис. 5.3. Схема программного замораживателя 
1.Морозильная камера; 2.Блок автоматики с датчиком температуры 
3.Сосуд Дьюара; 4.Электронное клапанное устройство

 

Снижение температуры происходит автоматически до заданного программой уровня. Затем пайеты быстро переносят в жидкий азот для хранения (рис. 5.4).

Рис. 5. 4. Перенос пайеты из замораживателя DB1 EmbryoFreeze в сосуд Дьюара  

Методика размораживания эмбрионов:

1. Достают  пайеты из сосуда Дьюара, выдерживают  на воздухе 10 секунд при комнатной  температуре и погружают на 10 секунд в водяную баню (оттаиватель) при температуре 25°С. 
2. Содержимое пайет вместе с эмбрионом переносят на часовое стекло и делают последовательную проводку (перемещение) по нисходящей концентрации растворов, либо удаляют криопротектор одноступенчато (табл. 5.5). 
3. После морфологической оценки качества эмбрионов их заправляют в пайеты вышеуказанным способом. 
4. Пайету вставляют в металлический цилиндр катетера. 
5. Одевают вначале защитный чехол, затем поверх него полиэтиленовый санитарный чехол. На нем указывают номер закрепленного животного-реципиента, которому и пересаживают зародыш. 
6. Для пересадки эмбрионов используют животных-реципиентов не имеющих генетической ценности.

Таблица 5.5. Методика удаления криопротекторов из эмбрионов  

 

Методика охлаждения эмбрионов в замораживателе.

1. Подача  жидкого азота обеспечивается  действием электронного клапанного  устройства 4 (рис. 5.3) и производится  в направлении из сосуда Дьюара (3) в морозильную камеру снизу (1). 
2. Сигналы с датчика температуры (2), размещенном внутри электронного блока автоматики, обуславливают подачу ответного сигнала на клапан (4), регулируя тем самым скорость охлаждения. 
3. После окончания программы замораживания пайеты, фиксируя пинцетом за пластиковые пробки, быстро переносят из морозильной камеры программного замораживателя в стандартную канистру с жидким азотом сосуда Дьюара (рис. 5. 4). 
Микроскопическая оценка качества. В технологии трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота оценке биологической полноценности зародышей придается большое значение. Оценивают их качество на основании определения стадии развития, состояния оболочек и внутренних структур. 

Биологически полноценнымипринято считать эмбрионы, которые имеют: 

1. Правильную шарообразную форму; 
2. Гомогенную светлую цитоплазму; 
3. Неповрежденную прозрачную оболочку; 
4. Одинакового размера бластомеры с плотным межклеточным контактом. 
5. Они должны соответствовать по уровню дробления возрасту от момента оплодотворения до их извлечения. 
При оценке эмбрионов соблюдают следующую последовательность: 
1. После процедуры промывания рогов матки коровы-донора мерные бутыли с полученной жидкостью передают через окно-шлюз в стерильный бокс. 
2. Осаждение эмбрионов производят в течение 20 минут в термостате при 37°С. 
3. Верхнюю часть жидкости из каждой емкости удаляют с помощью сифона, оставляя 50-100 мл. 
4. Отстой переносят в 2-3 пластмассовые чашки Петри, дно которых для удобства подсчета эмбрионов расчерчено на квадраты 0,8х0,8 см. 
5. Под микроскопом при 15-20-и кратном увеличении находят эмбрионы и шприцем емкостью на 1 см3 (через присоединенную к нему укороченную пайету) переносят на малое часовое стекло в 1 мл солевого раствора Дюльбекко для кратковременного хранения и морфологической оценки при увеличении в 100 раз. 
Выявляют неоплодотворенные яйцеклетки, без признаков развития и с дегенеративными изменениями оболочки или цитоплазмы (рис. 5. 5; 1). Дегенерированные яйцеклетки имеют: сморщенную, неправильной формы цитоплазму. Нередко наблюдается разрушение цитоплазмы; растягивание, разрыв или расслоение прозрачной оболочки (рис. 5.5;2).