Основы биотехнологии

 

 

I. ОСНОВНЫЕ ТИПЫ БИОПРОЦЕССОВ

 

ПРОИЗВОДСТВО  БИОМАССЫ

 

В настоящее время  существуют следующие основные типы биопроцессов:

• производство биомассы (например, белок одноклеточных);
• клеточных компонентов (ферменты, нуклеиновые кислоты и т.д.)
• метаболитов (химические продукты метаболической активности), включая первичные метаболиты, такие как этанол, молочная кислота;
• вторичные метаболиты ;
• односубстратные конверсии (превращение глюкозы во фруктозу);
• многосубстратные конверсии (обработка сточных вод, утилизация лигноцеллюлозных отходов).

 

Человек традиционно  получает белки, жиры и углеводы (основные компоненты пищи) из животных и растительных источников. Уже сегодня эти источники не покрывают все увеличивающиеся потребности человечества. Выяснилось, что белки и жиры микроорганизмов с успехом могут заменить белки и жиры традиционного происхождения. Преимущества микроорганизмов как продуцентов белка состоит в высоком содержании белка в биомассе и высокой скорости роста микроорганизмов.

Термин белок одноклеточных (БОК) был предложен в 1966 г. для  обозначения биомассы различных  микроорганизмов (бактерий, дрожжей, грибов и водорослей). Кроме высокого содержания белка микробная биомасса содержит также жиры, нуклеиновые кислоты, витамины и минеральные компоненты. Источниками получения пищевого белка могут стать также белковые изоляты из различных видов зеленой биомассы, в т.ч. из табака.

Для получения БОК  используют самые разнообразные  субстраты, включая парафины нефти, метан, водород, метанол, этанол, уксусную кислоту, углекислый газ, молочную сыворотку, мелассу, крахмал и целлюлозосодержащие  отходы промышленности и сельского хозяйства.

Для промышленного использования  перспективными являются термофильные (растущие при высоких температурах до 50^о С) микроорганизмы. Качество биомассы оценивается по высокому содержанию белка, низкому содержанию нуклеиновых кислот и отсутствию вредных веществ.

 

ПОЛУЧЕНИЕ СПИРТОВ  И ПОЛИОЛОВ

 

 

 

 Некоторые дрожжи и бактерии способны продуцировать  этанол и бутанол, а также такие  полиспирты как глицерин и 2,3-бутандиол. Эти продукты обычно синтезируют  из нефти, однако микробное получение  этанола и других спиртов вызывает все больший интерес.

В России большая часть  этанола получается микробиологическим путем из растительного сырья. Сдвиг  в сторону получения микробиологического  этанола наблюдается и в др. странах. Найдены бактерии Zymomonas mobilis, которые вдвое эффективнее сбраживают углеводы в этанол, чем дрожжи.

В Бразилии производство топливного спирта вносит наибольший вклад в энергобаланс страны и  составляет миллиарды литров.

Ферментация мелассы  различными видами Clostridium может быть использована для получения не только этанола, но и ацетальдегида, уксусной кислоты, этилацетата и диэтилового эфира. При изменении условий культивирования, например, в условиях щелочной среды вместо этанола образуется глицерин.

Сырьем могут быть гидролизаты древесины, меласса, крахмал, молочная сыворотка. Отходы производства этанола содержат белки, углеводы, рибофлавин и др. витамины, и могут использоваться как кормовая добавка.

Штаммы-продуценты первичных  метаболитов получают путем индуцированного  мутагенеза, так как в природе мутации, ведущие к сверхпродукции одного из метаболитов вредны. Нарушения в обмене веществ приводят к снижению конкурентоспособности и жизнеспособности микроорганизмов.

 

 

 

 

 

ПРОИЗВОДСТВО  ВТОРИЧНЫХ МЕТАБОЛИТОВ

 

 

 

 Из  всех продуктов, получаемых с помощью микробных процессов, наибольшее значение имеют вторичные метаболиты. Вторичные метаболиты, называемые также идиолитами,—низкомолекулярные соединения, не требующиеся для роста в чистой культуре. Они производятся ограниченным числом таксономических групп и часто представляют собой смесь близкородственных соединений, относящихся к одной и той же химической группе.

К вторичным метаболитам  относятся антибиотики, алкалоиды, гормоны роста растений и токсины.

Молекулы антибиотиков очень разнообразны по составу и механизму действия на микробную клетку. При этом в связи с возникновением устойчивости патогенных микроорганизмов к старым антибиотикам постоянно существует потребность в новых. В некоторых случаях природные микробные антибиотические продукты химическим или энзиматическим путем могут быть превращены в так называемые полусинтетические антибиотики, обладающие более высокими терапевтическими свойствами.  

Микроорганизмы, производящие вторичные метаболиты, вначале проходят стадию быстрого роста, тропофазу, во время которой синтез вторичных веществ незначителен. По мере замедления роста из-за истощения одного или нескольких необходимых питательных веществ в культуральной среде микроорганизм переходит в идиофазу; именно в этот период синтезируются идиолиты.

Эти особенности культурального роста необходимо учитывать при  производстве. Например, в случае  антибиотиков большинство микроорганизмов в процессе тропофазы чувствительно к собственным антибиотикам, однако во время идиофазы они становятся к ним устойчивыми.

Чтобы уберечь микроорганизмы, продуцирующие антибиотики, от самоуничтожения, важно быстро достичь идиофазы и  затем культивировать микроорганизмы в этой фазе. Это достигается путем  варьирования ежимов культивирования  и составом питательной среды на стадиях быстрого и медленного роста.

 

МИКРОБНЫЕ БИОТРАНСФОРМАЦИИ

 

 

Микроорганизмы способны осуществлять реакции трансформации, в которых те или другие соединения превращаются в новые продукты. Условия  протекания этих реакций мягкие, и  во многих случаях микробиологические трансформации предпочтительнее химических.

Пример существующих крупномасштабных промышленных биоконверсий - производство уксуса из этанола, глюконовой кислоты из глюкозы.

Широко используется микробная модификация стероидов, которые являются сложными полициклическими липидами. Теперь с использованием биоконверсии получают кортизон, гидрокортизон, преднизолон и целый ряд других стероидов. Применение и совершенствование микробной технологии в сотни раз снижает себестоимость производства стероидов.

 

 

ПРОИЗВОДСТВО  ФЕРМЕНТОВ

 

 

Получение ферментов  с помощью микроорганизмов более  выгодно, чем из растительных и животных источников. Микробные клетки продуцируют  более 2 тысяч ферментов, катализирующих биохимические реакции, связанные  с ростом, дыханием и образованием продуктов. Многие из этих ферментов могут быть выделены и проявляют свою активность независимо от клетки.

В мире производится около 20 ферментов в объеме 65 тыс. тонн (а существует, как предполагают 25000 ферментов). Например, промышленным способом производят такие ферменты как амилаза, глюкоамилаза, протеаза, инвертаза, пектиназа, каталаза, стрептокиназа, целлюлаза и др.

Амилазы и протеазы используют в текстильной, хлебопекарной и  кожевенной промышленности. Пектолитические  ферменты могут быть использованы для мацерации тканей при переработке растительного сырья, например при получении льноволокна. Щелочные протеазы, особенно иммобилизованные, очень эффективно используются в составе моющих средств. Кроме протеолитических ферментов в состав моющих средств вводят липазу, целлюлазу, оксидазу и амилазу для удаления загрязнений крахмального происхождения. Использование иммобилизованной глюкозоизомеразы для непрерывного получения глюкозы является наиболее крупным процессом такого рода в мире.

Микробные ферменты активно  используют в клинической диагностике  при определении уровня холестерина  в крови и мочевой кислоты. Ферменты предлагают использовать для  очистки канализационных и водопроводных  труб и т.д. и т.п. Ферменты для  медицинских или аналитических целей должны быть высокоочищенными.

Для повышения стабильности выделенных ферментов используют технику  иммобилизации, т.е. связывания ферментов  на поверхности нерастворимого в  воде носителя, например, органических полимеров, стекла, минеральных солей, силикатов и т.п. Иммобилизованные ферменты (ИФ) можно длительное время использовать в биохимических реакторах в условиях непрерывного процесса.

Примеры использования  ИФ - изомеризация глюкозы во фруктозу, гидролиз белков, трансформация стероидов, гормонов и т.д. Новая область применения ИФ - создание на их основе бессеребряных фотоматериалов. На основе действия ферментов построены биолюминесцентные и иммуноферментные методы анализа, отличительной чертой которых является высокая чувствительность и абсолютная специфичность.

АМИНОКИСЛОТЫ, ОРГАНИЧЕСКИЕ КИСЛОТЫ, ВИТАМИНЫ И ДРУГИЕ БИОПРОДУКТЫ

 

 

Производство аминокислот  относится к одной из наиболее передовых областей биотехнологии. Аминокислоты получают путем химического  синтеза или экстракцией из белковых гидролизатов.

Незаменимые аминокислоты могут получаться микробиологическим путем более эффективно, чем путем  химического синтеза.

За рубежом 60% мощностей  по производству аминокислот занимают глутаминовая кислота, далее идут метионин, лизин и глицин. Глутаминовая кислота производится при участии в качестве продуцента штамма Corynebacterium. С помощью микроорганизмов можно получить до 60 органических кислот. Многие из них получаются в промышленном масштабе - итаконовая, молочная, уксусная, лимонная.

Лимонная кислота во всем мире успешно производится с  помощью гриба Aspergillus niger. Уксусную кислоту  получают путем микробиологической конверсии водорода и углекислого  газа бактериями Acetobacterium woodi и Clostridium aceticum.

Витамины синтезируют в основном химическим путем или получают из естественных источников. Однако рибофлавин (В2), витамин В12 и аскорбиновую кислоту получают микробиологическим путем. Существует производство рибофлавина на основе использования дрожжеподобных грибов Eremothecium ashbyii и Ashbia gossypii. Рибофлавин продуцируется также видами Clostridium и Ascomycetes.

Микроорганизмы являются также ценным источником получения  никотиновой кислоты (витамин РР).

Микроорганизмы являются источником получения липидов специального назначения с заранее определенными свойствами. Микробные жиры заменяют растительные (а в ряде случаев и превосходят)и могут использоваться в разных отраслях промышленности, с.-х., медицине.

Микроорганизмы являются важным источником получения полимерных материалов на основе полисахаридов. Ценным микробным полисахаридом является декстран, образуемый бактериями рода Leucomonstoс. Декстран служит основой получения медицинских препаратов (кровезаменителей) и препаратов для биохимических исследований - сефадексов и др. молекулярных сит.

Микроорганизмы являются источником получения нуклеозидов  и нуклеотидов и их производных, поверхностно-активных веществ и т.д.

 

 

 

 

 

БИОКОНВЕРСИЯ  ЛИГНОЦЕЛЛЮЛОЗНЫХ ОТХОДОВ

 

 

 

Растительная биомасса - возобновляемый и легкодоступный источник сырья. Основные ее компоненты - целлюлоза (2/3), крахмал, гемицеллюлоза, лигнин. Лигнин - высокомолекулярный нерастворимый трехмерный неупорядоченный ароматический полимер. Целлюлоза - высокомолекулярный нерастворимый полимер глюкозы. Она является главным компонентом как растительной биомассы, так и сельскохозяйственных, бытовых отходов, а также отходов деревообрабатывающей и целлюлозно-бумажной промышленности.

В основе биологической  деградации лигноцеллюлозы лежит действие целлюлолитических ферментов. Реакционная способность природных целлюлозосодержащих материалов невелика, поэтому сырье для ферментативного осахаривания целлюлозы должно иметь большую поверхность, а микрофибриллярная структура целлюлозы должна быть разрушена. Реакционную способность природных субстратов также снижает наличие лигнина. Наиболее эффективным, а также дорогим и энергоемким способом предварительной подготовки сырья является размол. Поэтому для предобработки используют воздействие 0.5-2% растворов щелочи, гамма-облучение, механо-термообработку в разбавленной серной кислоте с последующей экстракцией лигнина и др. методы.

Гидролиз можно проводить  и биологическим способом, с помощью  ферментов, выделяемых грибами видов Trichoderma, Aspergillus, Sporotrichum. Далее при  использовании дрожжей можно получить спирт, при использовании бактерий Klebsiella или Aeromonas - бутанол. Ряд микроорганизмов рода Clostridium могут продуцировать уксусную и молочную кислоты, лактат, ацетон из опилок, соломы, отходов сахарного тростника. С помощью Trichoderma reesii биомасса разлагается до сахаров.

Ферменты и неразложившаяся  целлюлоза поступают в повторные  циклы, а остаточный лигнин используется в качестве источника энергии  для перегонки спирта. Технология, разработанная в Арканзасском университете и используемая в промышленности нефтяной компанией «Галф ойл», заключается в одновременном осахаривании целлюлозы и сбраживании сахаров, полученных путем гидролиза. Для этого к смеси целлюлозной биомассы и дрожжей добавляют раствор целлюлаз.

Остающийся лигнин также используется для перегонки в качестве топлива, но пентозы не сбраживаются. Фирма «Био фьюэл индастриз» из Ричмонда намерена построить в шт. Вирджиния фабрику, на которой в 1985 г. будет производиться 500 т этилового спирта в сутки из 2500 т целлюлозных отходов посредством этой технологии и целлюлаз из Trichoderma reesii.