Количественное определение флавоноидов и фенолокислот в надземной части соссюреи спорной

 

Государственное бюджетное образовательное  учреждение

высшего профессионального образования

«Сибирский государственный медицинский  университет»

Министерства здравоохранения  и социального развития Российской Федерации

(ГБОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития  России)

 

Фармацевтический факультет

 

Кафедра  фармацевтической химии

 

 

 

 

Сертификационная работа

 

Количественное определение  флавоноидов и фенолокислот в надземной части соссюреи спорной

 

 

 

 

 

Специальность «фармация»

Зав. кафедрой, д.ф.н.,

профессор___________Ермилова Е.В.

Руководитель, ст. препод.,

к.ф.н. ___________ Авдеева Е.Ю.

 

Интерн _____________Соколова С.Н.

 

 

 

 

 

 

Томск  - 2012   

 Содержание

 

Содержание 2

Введение 3

1. Разработка методики определения флавоноидов в надземной части соссюреи спорной 4

1.1. Определение оптимальных  условий экстракции рутина из надземной части соссюреи спорной 6

1.1.1 Выбор оптимальной концентрации этанола 6

1.1.2. Определение оптимального соотношения сырье-экстрагент и кратности экстракции 6

1.1.3. Определение времени экстракции 7

1.1.4. Отработка условий проведения реакции 7

1.2. Определение содержания рутина в надземной части соссюреи спорной 8

1.3. Определение оптимальных условий экстракции гликозидов кверцетина в надземной части соссюреи спорной 10

1.3.1 Выбор оптимальной концентрации этанола 10

1.3.2 Отработка условий проведения гидролиза 10

1.3.3. Определение времени гидролиза 11

1.3.4. Отработка условий проведения реакции 12

1.4. Определение содержания гликозидов кверцетина в надземной части соссюреи спорной 13

2.Определение фенолокислот в надземной части соссюреи спорной. 14

2.1. Выбор оптимальной концентрации этанола 14

2.2. Определение содержания фенолокислот в надземной части 15

соссюреи спорной 15

Выводы 17

Список литературы 18

 

 

 

Введение

 

Известно, что в последние годы значительно возрос интерес к  препаратам растительного происхождения, и в современной медицине всё  более пристальное внимание учёных привлекают к себе лекарственные  растения. С каждым годом увеличивается  ассортимент фитопрепаратов, что  связано с их комплексным воздействием на организм, более мягким действием, меньшей токсичностью, чем у синтетических  средств, и возможностью длительного  применения без проявления побочных эффектов. В настоящее время многие растения, в том числе и представители  рода Saussurea, целебные свойства которых издавна используются народами мира для лечения различных заболеваний, остаются недостаточно изученными, что ограничивает их применение в официнальной медицине. В связи с этим одним из приоритетных направлений научных исследований является изучение химического состава растений, находящих широкое применение в народной медицине, выделение из них биологически активных веществ (БАВ) и разработка на их основе высокоэффективных лекарственных средств (ЛС).

В последние десятилетия возрос интерес к изучению химического  состава, и количественного содержания БАВ растений рода Saussurea [21], что свидетельствует о значительных потенциальных возможностях этих растений. Нами для исследования была выбрана соссюрея спорная (Saussurea controversa DC). Ранее в результате изучения химического состава надземной части растения нами обнаружены кумарины, флавонолы (кверцетин, кемпферол), флавонолгликозиды (в гидролизате кверцетин, кемпферол, мирицетин, D-глюкоза, D-галактоза), фенолокислоты, полисахариды, аминокислоты, конденсируемые дубильные вещества, выделены D-ксилоза, кверцетин, кемпферол, рутин,кверцетин-3,5-глюкоарабинозид, кофейная кислота и эскулетин.

Цель настоящей работы – количественное определение флавоноидов и гидроксикоричных кислот в надземной части соссюреи спорной.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Определить оптимальные условия экстракции флавоноидов и фенолокислот из надземной части соссюреи спорной.
2. Разработать методики количественного определения флавоноидов и фенолокислот из растения.
3. Определить сумму флавоноидов и гидроксикоричных кислот в растении.

Сертификационная работа выполнена в соответствии с планом научных исследований кафедры фармацевтической химии ГОУ ВПО Сибирского государственного медицинского университета Минздравсоцразвития России.

 

1. Разработка методики определения флавоноидов в надземной части соссюреи спорной

В исследованиях использовали надземную часть соссюреи спорной, собранную в Иркутской обл., в окрестностях п. Кочергат, в 2008-2010 г.

Определение содержания флавоноидов  проводили с использованием метода дифференциальной спектрофотометрии. Разработанная методика для определения флавоноидов по рутину основана на экстракции их из сырья водным этанолом с последующим проведением реакции комплексообразования с алюминия хлоридом в кислой среде. Ранее, исследования химического состава надземной части соссюреи спорной показали, что растение кроме рутина содержит другие гликозиды кверцетина. В связи с этим целесообразно определить их количественное содержание. Для этого полученный экстракт подвергали кислотному гидролизу. В качестве раствора сравнения использовали испытуемое извлечение в первом случае и гидролизат во втором без реактива, что позволило исключить влияние сопутствующих веществ, имеющих максимум поглощения в области аналитической длины волны, на результаты анализа.

Для определения аналитической  длины волны изучены УФ-спектры  Государственного стандартного образца (ГСО) рутина, кверцетина, и полученных водно-спиртовых экстрактов, а также продуктов кислотного гидролиза (ПКГ) спиртовых извлечений из надземной части соссюреи спорной. Максимум поглощения ГСО рутина после реакции комплексообразования находится в области 410 нм, и соотносится с максимумом поглощения водно-спиртового экстракта соссюреи спорной в определенной концентрации, что позволяет использовать данную длину волны в качестве аналитической для количественного определения содержания флавоноидов (рис. 1).

400

300

200

1

2

Рис. 1. УФ-спектры растворов ГСО рутина(1) и экстракта из надземной части соссюреи спорной на 70% этаноле(2) с 5% раствором AlCl₃.

Максимум поглощения кверцетина после реакции комплексообразования с раствором алюминия хлорида находится в области 425 нм и совпадает с таковым дифференциальной кривой ПКГ соссюреи спорной, что дает возможность использовать длину волны при 425 нм в качестве аналитической (рис.2).

400

300

200

1

2

 

Рис. 2. УФ-спектры  растворов ГСО кверцетина (1) и ПКГ экстракта из надземной части соссюреи спорной на 40% этаноле(2) с 5% раствором AlCl₃.

 

Следует отметить, что спектрофотметрические  характеристики 40% и 70% этанольного экстракта соссюреи спорной в диапазоне используемых концентраций подчиняются закону Бугера-Ламберта-Бера (рис.3).

Рис. 3. График зависимости изменения оптической плотности от количества экстракта из надземной части соссюреи спорной.

 

 

1.1. Определение оптимальных  условий экстракции рутина из надземной части соссюреи спорной

1.1.1 Выбор оптимальной концентрации этанола

Для проведения исследования готовили три пробы: по 1,0 г сырья, измельченного до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 2 мм помещали в колбы со шлифом вместимостью 100 мл, экстрагировали этанолом различной концентрации (20, 40, 70 и 95% соответственно) трижды по 30 мин на водяной бане при температуре 80 °С. Извлечения объединяли и фильтровали через бумажный фильтр («Красная лента») в мерные колбы вместимостью 100 мл, доводили соответствующим этанолом до метки (раствор А). 5 мл раствора А (аликвота) помещали в мерную колбу вместимостью 25 мл, добавляли 3 мл 5% этанольного раствора алюминия хлорида, доводили 95% этанолом до метки. Оптическую плотность измеряли на спектрофотометре «СФ2000» при l 410 нм через 60 мин.

В соответствии с результатами измерений, оптимальной  для извлечения рутина из надземной части соссюреи спорной является концентрация этанола 70% (табл. 1).

 

Таблица 1 – Зависимость содержания флавоноидов в экстракте соссюреи спорной от концентрации этанола

Концентрация этанола, %	Оптическая плотность			Среднее значение
20	0,235	0,249	0,280	0,254±0,034
40	0,314	0,315	0,306	0,312±0,007
70	0,412	0,413	0,380	0,401±0,028
95	0,327	0,227	0,296	0,283±0,077

 

1.1.2. Определение оптимального соотношения сырье-экстрагент и кратности экстракции

В связи  с тем, что объем получаемого  экстракта по условию ограничен колбой на 100 мл, то исследованию подвергались условия: двухкратная экстракция в соотношении сырье : экстрагент 1 : 45 и трехкратная экстракция в соотношении 1 : 30. Раствор А получали как указано выше, экстрагируя 70% этанолом, с использованием различного соотношения сырья и экстрагента (1:30, 1:45). 5 мл раствора А помещали в колбу вместимостью 25 мл, добавляли 3 мл 5% раствора алюминия хлорида, 0,1 мл хлористоводородный кислоты и доводили 95% этанолом до метки, по истечении 60 мин измеряли оптическую плотность образцов. Оптимальным является соотношение 1:30 (табл.2).

 

 

 

 

Таблица 2 – Зависимость содержания флавоноидов в экстракте соссюреи спорной от соотношения сырья и экстрагента

Соотношение	Оптическая плотность			Среднее значение
1:45	0,444	0,431	0,445	0,440±0,012
1:30	0,455	0,451	0,482	0,463±0,098

1.1.3. Определение времени экстракции

Испытуемые  образцы получали как описано  выше, используя в качестве экстрагента 70% водный этанол в соотношении 1:30, экстрагируя трехкратно, варьируя время экстракции (15, 30, 45 и 60 мин). 5 мл раствора А помещали в колбу вместимостью 25 мл, добавляли 3 мл 5% раствора алюминия хлорида, 0,1 мл хлористоводородный кислоты и доводили 95% этанолом до метки, по истечении 60 мин измеряли оптическую плотность образцов. Результаты измерений представлены в таблице 3. Оптимальное время экстракции составляет 45 мин.

Таблица 3 – Зависимость содержания флавоноидов в экстракте соссюреи спорной от времени экстракции

Время экстракции, мин	Оптическая плотность			Среднее значение
15	0,205	0,233	0,263	0,234±0,043
30	0,455	0,451	0,482	0,463±0,025
45	0,529	0,616	0,531	0,558±0,074
60	0,448	0,468	0,372	0,429±0,076

 

Таким образом, оптимальными условиями экстрагирования  являются: трехкратная экстракция 70% этанолом в соотношении 1:30 в течение 45 мин при температуре 80°С.

1.1.4. Отработка условий проведения реакции

Приготовление раствора А осуществляли в соответствии с методикой указанной  выше.

Для выбора количества добавляемого реактива в мерную колбу емкостью 25 мл помещали 5 мл (аликвота) раствора А, 5% этанольный раствор алюминия хлорида  в количестве 1, 3, 5 и 7 мл, доводили 95% этанолом до метки и 0,1 мл концентрированной хлористоводородной кислоты. Оптическую плотность измеряли на спектрофотометре «СФ2000» при l 410 нм через 60 мин.  (табл. 4).

Таблица 4 –  Зависимость величины оптической плотности  от количества 5% раствора алюминия хлорида

Количество 5% раствора алюминия хлорида, мл	Оптическая плотность			Среднее значение
1	0,386	0,376	0,356	0,372±0,023
3	0,412	0,413	0,380	0,401±0,028
5	0,431	0,435	0,400	0,422±0,029
7	0,382	0,381	0,340	0,367±0,036

Для определения количества добавляемой  концентрированной хлористоводородной кислоты в мерную колбу емкостью 25 мл помещали 5 мл раствора А, 5 мл 5% этанольного  раствора алюминия хлорида, концентрированной  хлористоводородной кислоты в количестве 0,1; 0,2; 0,3; 0,4 мл и доводили 95% этанолом до метки. Оптическую плотность измеряли на спектрофотометре «СФ2000» при l 410 нм (табл. 5).

Таблица 5 – Зависимость  величины оптической плотности от количества концентрированной хлористоводородной кислоты

Количество концентрированной  хлористоводородной кислоты, мл	Оптическая плотность			Среднее значение
0,1	0,383	0,318	0,386	0,362±0,058
0,2	0,431	0,435	0,400	0,422±0,029
0,3	0,570	0,520	0,568	0,552±0,042
0,4	0,528	0,547	0,427	0,500±0,097