Количественное определение флавоноидов и фенолокислот в надземной части соссюреи спорной

 

Для определения времени реакции  в мерную колбу емкостью 25 мл помещали 5 мл (аликвота) раствора А, 5 мл 5% этанольного раствора алюминия хлорида, 0,3 мл концентрированной хлористоводородной кислоты и доводили 95% этанолом до метки. Оптическую плотность измеряли на спектрофотометре «СФ2000» при l 410 нм через 30, 45, 60, 90 и 120 мин. Результаты показали, что оптимальным является время реакции 60 мин.

Таким образом, для полного проведения реакции необходимо вносить 5 мл 5% этанольного раствора алюминия хлорида и 0,3 мл концентрированной хлористоводородной кислоты. Время проведения реакции 60 мин.

1.2. Определение содержания рутина в надземной части соссюреи спорной

Определение рутина осуществляли по разработанной нижеизложенной методике.

Методика определения. Аналитическую пробу сырья массой 1,0 г (т.н.), измельченного до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 2-3 мм помещают в колбу со шлифом вместимостью 100 мл, экстрагируют 70% этанолом трижды по 45 мин на водяной бане при температуре 80 °С. Извлечения объединяют и фильтруют через бумажный фильтр («Красная лента») в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят 70% этанолом до метки (раствор А). 5 мл (аликвота) полученного раствора помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, добавляют 5 мл 5% этанольного раствора алюминия хлорида, 0,3 мл концентрированной хлористоводородной кислоты и доводят 95% этанолом до метки. Оптическую плотность измеряют на спектрофотометре при l 410 нм через 60 мин. Параллельно измеряют оптическую плотность раствора стандартного образца рутина. Для этого 1 мл 0,02% раствора рутина-стандарта помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 5 мл 5% раствора алюминия хлорида, 0,3 мл концентрированной хлористоводородной кислоты и доводят до метки 95% этанолом.

Приготовление раствора Государственного стандартного образца (ГСО) рутина: 0,0050 г (точная навеска) ГСО рутина, высушенного до постоянной массы при температуре 100-105 °С, растворяют в мерной колбе вместимостью 25 мл в небольшом количестве подогретого 95% спирта этилового и доводят объем раствора тем же спиртом до метки.

Расчет  процентного содержания флавоноидов  в пересчете на рутин осуществляют по формуле:

Х _{(%)  =} D · Mо · 100 · 25 · 1 · 100 · 100 ₌ D · Mо · 8000   ,

                 Dо · М · 5 · 25 · 25 · (100-W)             Dо · М · (100-W)

где  D- оптическая плотность испытуемого раствора;

Dо- оптическая плотность ГСО рутина (среднее из трех измерений), равная 0,243;

Mо- масса ГСО рутина, г;

М- масса  навески сырья, г;

W- влажность, %.

Результаты измерений представлены в таблице 7.

Таблица 6 – Содержания флавоноидов в экстракте из надземной части соссюреи спорной разного года сбора.

№ опыта	Сырье 2008 г сбора Срок хранения 4 года		Сырье 2009 г сбора Срок хранения 3 года		Сырье 2010 г сбора Срок хранения 2 года
	Ā	X	A	X	A	X
1	0,257	0,45	0,380	0,67	0,429	0,75
2	0,167	0,29	0,401	0,70	0,416	0,73
3	0,157	0,27	0,380	0,67	0,431	0,76
4	0,276	0,48	0,451	0,79	0,403	0,71
5	0,257	0,45	0,439	0,77	0,307	0,54
6	0,169	0,30	0,474	0,83	0,424	0,74
Ā /	0,213	0,37±0,07	0,421	0,60±0,07	0,402	0,71±0,07
Параметры статистической обработки	σ2= 0,000572; σ= 0,0756; σх=0,03087; Ip=0,07; А = 9,86

 

1.3. Определение оптимальных условий экстракции гликозидов кверцетина в надземной части соссюреи спорной

1.3.1 Выбор оптимальной концентрации этанола

Для проведения исследования готовили три пробы: по 1,0 г сырья, измельченного до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 2 мм помещали в колбы со шлифом вместимостью 100 мл, экстрагировали этанолом различной концентрации (20, 40, 70 и 90% соответственно) трижды по 30 мин на водяной бане при температуре 80 °С. Извлечения объединяли и фильтровали через бумажный фильтр («Красная лента») в мерные колбы вместимостью 100 мл, доводили соответствующим этанолом до метки (раствор А). 20 мл раствора А помещали в колбу со шлифом вместимостью 100 мл, добавляли 3% концентрированной хлористоводородной кислоты и нагревали на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течениие 2 ч. 1 мл раствора прогидролизованного раствора А (аликвота) помещали в мерную колбу вместимостью 25 мл, добавляли 3 мл 5% этанольного раствора алюминия хлорида, доводили 95% этанолом до метки. Оптическую плотность измеряли на спектрофотометре «СФ2000» при l 430 нм через 50 мин. В соответствии с результатами измерений, оптимальной для извлечения флавонолгликозидов из надземной части соссюреи спорной является концентрация этанола 40% (табл. 7). Что согласуется с ранее проведенными исследованиями, указывающими на гидрофильный характер гликозидов кверцетина соссюреи спорной.

Таблица 7 – Зависимость оптической плотности в экстракте соссюреи спорной от концентрации этанола

Концентрация этанола, %	Оптическая плотность			Среднее значение
20	0,194	0,174	0,210	0,192±0,054
40	0,366	0,375	0,304	0,348±0,058
70	0,223	0,224	0,260	0,236±0,032

 

1.3.2 Отработка условий проведения гидролиза

Приготовление раствора А проводили по описанной выше методике. 20,0 мл раствора А помещали в колбу со шлифом вместимостью 100 мл, добавляли 1% концентрированной хлористоводородной кислоты и нагревали на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 2 ч. Аналогичным образом осуществляли гидролиз раствора А с добавлением 3, 5, 7 и 9% концентрированной хлористоводородной кислоты. В колбу вместимостью 25 мл помещали 1 мл (аликвота) прогидролизованного раствора А, добавляли 3 мл 5% этанольного раствора алюминия хлорида, доводили 95% этанолом до метки. Оптическую плотность измеряли на спектрофотометре «СФ2000» при l 430 нм через 60 мин (табл. 8). В соответствии с результатами измерений для проведения гидролиза оптимально добавлять 3% концентрированной хлористоводородной кислоты.

 

Таблица 8 – Зависимость величины оптической плотности от количества хлористоводородной кислоты, используемой при гидролизе этанольного извлечения соссюреи спорной

Количество конц. НСl в экстракте, %	Оптическая плотность			Среднее значение
1	0,243	0,151	0,204	0,199±0,069
3	0,366	0,375	0,304	0,348±0,058
5	0,251	0,228	0,204	0,228±0,035
7	0,149	0,190	0,191	0,177±0,036
9	0,191	0,190	0,190	0,190±0,001

1.3.3. Определение времени гидролиза

 Для определения времени  гидролиза 20,0 мл раствора А  помещали в колбу со шлифом  вместимостью 100 мл, прибавляли 3% концентрированной хлористоводородной кислоты и нагревали на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 30 мин. Аналогичным образом осуществляли гидролиз в течение 60, 90, 120 и 150 мин. В колбу вместимостью 25 мл помещали 1 мл (аликвота) прогидролизованного раствора А, добавляли 3 мл 5% этанольного раствора алюминия хлорида, доводили 95% этанолом до метки. Оптическую плотность измеряли на спектрофотометре «СФ2000» при l 430 нм через 60 мин. (табл. 9). 

 

Таблица 9 – Зависимость величины оптической плотности от времени проведения гидролиза этанольного извлечения соссюреи спорной

Время проведения гидролиза, мин	Оптическая плотность			Среднее значение
30	0,172	0,189	0,239	0,200±0,056
60	0,200	0,206	0,244	0,216±0,036
90	0,221	0,255	0,232	0,236±0,026
120	0,366	0,375	0,304	0,348±0,058
150	0,300	0,310	0,270	0,293±0,031

 

Исходя  из результатов эксперимента, гидролиз проходит полностью при добавлении 3% концентрированной хлористоводородной кислоты и нагревании на кипящей  водяной бане в течение 120 мин.

 

1.3.4. Отработка условий проведения реакции

Приготовление раствора А и его  гидролиз осуществляли в соответствии с методикой указанной выше.

Для выбора количества добавляемого реактива в мерную колбу емкостью 25 мл помещали 1 мл (аликвота) прогидролизованного  раствора А, 5% этанольный раствор алюминия хлорида в количестве 1, 2, 3, 4 и 5 мл, доводили 95% этанолом до метки. Оптическую плотность измеряли на спектрофотометре «СФ2000» при l 430 нм через 60 мин.  (табл. 10).

Таблица 10 – Зависимость величины оптической плотности от количества 5% раствора алюминия хлорида

Количество 5% раствора алюминия хлорида, мл	Оптическая плотность			Среднее значение
1	0,151	0,143	0,150	0,148±0,006
3	0,261	0,275	0,274	0,270±0,012
5	0,197	0,198	0,187	0,194±0,009

 

Для определения времени реакции  в мерную колбу емкостью 25 мл помещали 1 мл (аликвота) прогидролизованного  раствора А, 3 мл 5% этанольного раствора алюминия хлорида и доводили 95% этанолом до метки. Оптическую плотность измеряли на спектрофотометре «СФ2000» при l 430 нм через 10, 20, 30, 40, 45, 50, 60, и 70 мин (рис. 4).

 

Рис 4 Зависимость величины оптической плотности от времени проведения реакции.

 

Таким образом, для полного проведения реакции необходимо вносить 3 мл 5% этанольного  раствора алюминия хлорида. Время проведения реакции 50 мин.

 

1.4. Определение содержания гликозидов кверцетина в надземной части соссюреи спорной

Определение содержания гликозидов кверцетина проводили  по разработанной нижеизложенной методики.

Методика определения. Аналитическую пробу сырья массой 1,0 г (т.н.), измельченного до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 2-3 мм помещают в колбу со шлифом вместимостью 100 мл, экстрагируют 40% этанолом трижды по 45 мин на водяной бане при температуре 80 °С. Извлечения объединяют и фильтруют через бумажный фильтр («Красная лента») в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят 40% этанолом до метки (раствор А). 20 мл раствора А помещают в колбу со шлифом вместимостью 100 мл, прибавляют 3% конц. хлористоводородной кислоты и нагревают на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 120 мин. 1 мл (аликвота) полученного раствора помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, добавляют 3 мл 5% этанольного раствора алюминия хлорида и доводят 95% этанолом до метки. Оптическую плотность измеряют на спектрофотометре при l 425 нм через 50 мин. Параллельно измеряют оптическую плотность раствора стандартного образца кверцетина. Для этого 1 мл 0,02% раствора кверцетин-стандарта помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 3 мл 5% раствора алюминия хлорида и доводят до метки 95% этанолом.

Приготовление раствора Государственного стандартного образца (ГСО) кверцетина: 0,0050 г (точная навеска) ГСО кверцетина, высушенного до постоянной массы при температуре 100-105 °С, растворяют в мерной колбе вместимостью 25 мл в небольшом количестве подогретого 95% спирта этилового, прибавляют 1 каплю концентрированной хлористоводородной кислоты и доводят объем раствора тем же спиртом до метки.

Результаты измерений представлены в таблице 11.

Расчет  процентного содержания флавоноидов  в пересчете на кверцетин осуществляли по формуле:

Х _{(%)  =} D · Mо · 100 · 25 · 1 · 100 · 100 ₌ D · Mо · 40000   ,

                 Dо · М · 1· 25 · 25 · (100-W)             Dо · М · (100-W)

где  D- оптическая плотность испытуемого раствора;