Біосинтез лікопіну

Культивування в промислових  масштабах проводиться глибинним  способом. Головними факторами, які  впливають на процес є склад поживного  середовища, та якість штамів-продуцентів [14] . Посівний матеріал повинен бути фізіологічно активним та відібраний із середини експоненційнї фази росту.

Виробничий процес проводиться періодичним способом [11] .

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

ТЕХНОЛОГІЧНА ЧАСТИНА  РОБОТИ

Розділ 3. Характеристика цільового продукту біосинтезу - лікопіну

Лікопін належить до класу  природних органічних сполук – каротиноїдів, які накопичуються в багатьох фруктах і овочах, формуючи їх колір [9].  Він входить до складу клітинної стінки зигоспор та спорангіоспор міцеліальних грибів [10] .

Емпірична формула сполуки (Рис.3.1) – С₄₀Н₅₆ , молекулярна маса – 536 г/моль.

 

Рис.3.1 Формула лікопіну

Барвник не розчиняється у  воді. Розчинниками каротиноїду є  різноманітні олії та жири (Рис.3.2). Температура плавлення становить 174⁰С [15] .

Рис.3.2. Екстракція лікопіну із біомаси гриба Blakeslea trispora органічним розчинником

 

3.1 Фармакологія лікопінових препаратів

Фармакодинаміка лікопінових  препаратів характеризується проявом  стимулювальної дії на основні види обміну речовин, зокрема білкового ( за рахунок підвищення рівня білків на 17 – 30% та оптимізації їх фракційного складу), вуглеводного (збільшення концентрації глюкози до 25,4%), вітамінного (збільшення вмісту каротиноїдів, вітамінів А та Е) та мінерального (збільшення концентрації цинку на 8,2-16,4 %). Також ця речовина стимулює еритро та гемопоез шляхом збільшення гемоглобіну на 15,7% та еритроцитів на 27,78%

Лікопін сприяє підвищенню антиоксидантного потенціалу організму за рахунок збільшення активності ферментів ( глутатіонпероксидази на 4,6%; глутатіонредуктази на 4%; супероксиддисмутази на 4,5-6,6% та каталази на 2,8-4,8%).

Введення барвника виявляє  потенціюючу дію на ферментативну ланку антиоксидантної системи. Посилюючи неферментативний захист каротиноїди сприяють більш економній витраті антиоксидантних ферментів в цілому.

Мембраностабілізуюча функція  каротиноїдів є однією з найважливіших  в організмі тварин та людини. Орієнтація молекули всередині бішару мембрани залежить від структури самих  каротиноїдів. Лікопін та β-каротин розміщуються у внутрішній  гідрофобній частині мембрани, тим самим активно впливаючи на її фізичні властивості: на проникність та ригідність, підтримуючи її повноцінність [16] .

Всмоктування лікопіну у  шлунково-кишковому тракті залежить від вмісту в харчових продуктах  жирів. Лікопін у складі ліпідної міцели підходить до стінок тонкого  кишківника, при цьому він розміщений всередині цієї міцели. В ентероцит  вона потрапляє шляхом пасивної дифузії. В кров’яне русло лікопін входить  у складі хіломікрону. Біодоступність становить 40%. В крові він транспортується  разом із ліпопротеїнами [17] .

  РОЗДІЛ 4. Обгрунтування вибору технологічної схеми

4.1Обгрунтування вибору біологічного агента

Для отримання високої  концентрації  цільового продукту у хімічно стабільній формі потрібен високопродуктивний біологічний агент.

Як продуценти лікопіну були описані культури Streptomyces chrestomyceticus, Blakeslea trispora, Phycomyces blakesleeanus, Flavobacterium sp. Однак у більшості випадків при культивуванні вихід  цільового продукту досить низький, і синтезується він лише в комплексі з іншими каротиноїдами [19] .

 Велику кількість антиоксиданту накопичують пурпурові бактерії  (Thiocystic sp.), мікрококи (Micrococcus tetragenus) та мікобактерії (Mycobacterium kanaasli, Mycobacteriuml acticom) [7] .

 Актиноміцети (Streptomyces var.rabescens, Actinomyces galbus, Streptomyces chrestomyceticus var.Ayrantioides) також є продуцентами  лікопіну.   Найактивнішим  серед водоростей є Chara ceratophylla .

  Перше місце серед надсинтетиків лікопіну посідають гриби. Найперспективнішими є представники порядку Mucorales: Blakeslea trispora, Phycomyces blakesleeanus, Choanephora cucurbitаrum, Aspergillus giganteus деякі види Penicillium та Fusarium sporotrichoides [20] .

    Однак не всі із наведених мікроорганізмів можуть бути використані у промислових масштабах.

            Так, процес накопичення лікопіну в актиноміцетів є дуже тривалим. Наприклад,  у Streptomyces var.rabescens  він триває 8 діб, що сприяє збільшенню вартості кінцевого продукту.

Відомий штам бактерій Mycobacterium rubrum, який на середовищі з патокою та кукурудзяним екстрактом накопичує до 7,05 мг/г сумарних каротиноїдів. При цьому в пігментному комплексі бактерій крім лікопіну виявлений ауроксантин, лютеїн, криптоксантан, віолоксантин, зеаксантин, антераксантин, рубіксантин, лепротеїн, неоксантин. Тобто для виділення заданого каротиноїду   потрібно провордити додаткові операції очистки, що сприяє підвищенню  його вартості  [7] .

Штам дріжджів  Rhodotorula glutinis 214 (SU 531844), який вирощували на мінеральному середовищі, та в якості джерела вуглецю використовували вуглеводні нафти, накопичував близько 800 мкг/г сухої біомаси. Недоліком даного штаму є низький рівень накопичення каротиноїдів.

       Штам  дріжджів Sporobolomyces pararosens Т (SU 391174), який вирощували на середовищі, що містило гідролізат торфу, накопичував         3200 мкг/л  каротиноїдів. Недоліком  даного штаму, як і попереднього, є низький рівень накопичення каротиноїдів та велика  тривалість процесу [21] .

Результати вирощування  культури Streptomyces globisporus 4Lcp на трьох середовищах, які містили нітрат як джерело азоту і глюкозу, гліцерин та крохмаль як джерела вуглецю показали, що  вихід лікопіну становив  2,0 – 3,0 мг/л. При культивуванні використовували синтетичне поживне середовище,  що суттєво збільшувало вартість цільвого продукту [22] .

Гриб  Fusarium sporotrichoides  здатен синтезувати до 0,5 мг/г лікопіну [20], що є недостатнім для промислових масштабів.

Продуцентами синтезу  лікопіну є Т (+) та  Т (-), ВКМ F-904 (+), ВКМ F-903 (+), ВКМ F-812 (+) штами Blakeslea trispora (Рис.4.1). Поживне середовище містить 4% соєвого борошна та 1,75 % кукурудзяного борошна, що використовуються як джерела вуглецю та азоту відповідно. Вихід лікопіну становить 1,3-1,5 г/л [23].

Дані штами є  вигідними  за  виробничими показниками та технологічно. Вони не потребують внесення додаткових хімічних речовин, що стимулюють утворення лікопіну, ростуть на простих та доступних поживних середовищах та синтезують лікопін у достатній для промислових масштабів кількості.

 

Рис.4.1. Пробірки з міцелієм гетероталічного гриба Blakeslea trispora

          Дані штами мають свої недоліки, пов’язані з тим, що виділення  барвника  здійснюється на хроматографічних  колонках, що є молодоступним способом. Також недоліком є те, що для циклізації  лікопіну потрібні дорогі та дефіцитні домішки. Тож це дає поштовх для майбутніх досліджень, спрямованих на здешевлення промислового виробництва.

4.2 Обгрунтування вибору складу поживного середовища

Для здійснення біохімічних  перетворень всередині кліти, їй необхідні джерело вуглецю та енергії, джерело азотного живлення, мінеральні солі та додаткові фактори  росту. Всі ці компоненти мікробна клітина  отримує із поживного середовища.

Від умов культивування та складу поживного середовища залежить якість цільвого продукту, його кількість  та чистота.

Так, для синтезу каротиноїдів необхідно підібрати оптимальне поживне середовище, адже зміна кількісного  чи якісного складу будь-якого компонента приводить до зміни кількісного  складу мікробних ліпідів. Наприклад, дефіцит фосфатів сприяє синтезу  гліколіпідів; стресові фактори змінюють співвідношення жирних кислот у складі мікробних ліпідів [24] .

До складу мікробної клітини  входять такі елементи: (% до сухої  маси речовини): вуглець – 50; кисень – 20; азот – 10-14;водеь – 8; фосфор – 3; сірка,калій, натрій – 1; кальцій, магній, хлор – 0,5; залізо – 0,2; решта елементів – приблизно 0,3.

Поживне середовище, на якому  відбувається культивування гетероталічного  мукорового гриба Blakeslea trispora повинно містити всі ці компоненти у достатній кількості та у доступній формі.

Для виробництва різних каротиноїдів використовують також додаткове  внесення активаторів чи інгібіторів  росту.

Існує декілька видів складу поживного середовища для культивування  гриба:

          Середовище №1г/л:

Глюкоза                         59,4

L-аспарагін                    2,12

Дріжджовий екстракт    1,42

КН₂РО₄                                   1,26

MgSО₄•7H₂О          0,4

Вітамін А                        1    [7]

Таке середовище не можна  використовувати для промислового культивування, тому що у ньому відсутні рослинні олії які є стимуляторами  утворення лікопіну. Крім того рослинні олії можуть бути піногасниками, відсутність  яких приводить до порушення стерильності процесу. Дане поживне середовище можна  використовувати для виділення  мутантного штаму-продуцента Blakeslea trispora.

Середовище №2 г/л:

Кукурудзяне борошно            23;

Соєве борошно                        47;

КН₂РО₄                                     0,5;

Тіамін                                       0,002 [1] .

Дане середовище, як і  попереднє не містить рослинних  олій, і тому у виробничому процесі  його можна використовувати лише для накопичення посівного матеріалу.

Для промислового культивування  використовують середовище наступного складу, г/л:

Мальтозний сироп                      120;

Кукурудзяний екстракт              60;

Хлібопекарські дріжджі (сухі)   0,5;

КН₂РО₄                                                                   0,5;

NaCl                                                3;

MnSО₄ 7H₂О                               0,1;

Тіамін                                            0,002;

Соєва олія                                     40

Вода водопровідна                          848-714.

Воно відповідає необхідним вимогам. Так, мальтозний сироп складається  із легкозасвоюваних цукрів, які в  свою чергу є джерелами вуглецю, сприяє пришвидшенню росту біомаси. Поєднання його з рослинними оліями стимулює утворення лікопіну. Азот, необхідний для мікробної клітини  міститься в кукурудзяному екстракті. Крім того, останній використовується також як додаткове джерело енергії  через вміст вуглецю у своєму складі. Хлібопекарські дріжджі використовуються в якості ростового фактора. Blakeslea trispora є ауксотрофом за тіаміном, тому необхідне його екзогенне внесення до поживного середовища.

В результаті промислового  культивування на середовищі заданого складу вихід лікопіну становить 1,36 – 1,6 г/л. Концентрація біомаси – 42 г/кг [11] .

4.3 Розрахунок складу поживного середовища

За 120 годин культивування  концентрація лікопіну у культуральній  рідині становить 1,6 г/л, а концентрація біомаси – 42 г/л. Виходячи з таких  даних можна розрахувати базове поживне середовище, необхідне для  вирощування ауксотрофного за тіаміном штаму Blakeslea trispora.

Розрахунок вмісту у середовищі джерела вуглецю:

Джерелами вуглецевого живлення в середовищі культивування є  мальтозний сироп, який містить у  своєму складі 43% цукрів, та рослинні олії ( в основному соєва).

Згідно умови вихід  лікопіну становить 1,6 г/л. Його молекулярна  маса становить 537 г/моль. Отже, в 537 г  продукту – 480 г вуглецю, тоді у 1,6 г  його кількість (480×1,6) / 537 = 1,43 г.

У біомасі – 50% вуглецю, отже у 42 г біомаси є 42×0,5 = 21г вуглецю. 

Тобто для утворення лікопіну та для синтезу біомаси до складу поживного середовища повинно входити 21+1,43 = 22,43 г вуглецю. Зважаючи на те, що джерелами вуглецевого живлення є мальтозний сироп та соєва олія потрібно підібрати їх оптимальне співвідношення. Приймаємо, що співвідношення компонентів 3:1 відповідно. Тоді (22,43 / 3 ) = 7,43 г вуглецю  має забезпечуватись із соєвої олії, а (7,43× 2) ≈ 15 г – із мальтозного сиропу.

Мальтозний сироп.

Для синтезу біомаси потрібно у (21 / 1,43) = 14,7 разів більше вуглецю, ніж  для утворення лікопіну. Приймемо потребу вуглецю для синтезу  цільового продукту за 1, тоді потреба  для утворення біомаси становить 14,7. Можна зробити запис: 15,7 •  х = 15, звідки х = 0,96.

Тобто для утворення антиоксиданту  необхідно 0,96 г/л вуглецю.

Потреби для синтезу  лікопіну

Вміст вуглецю в цукрах мальтозного сиропу становить 40% , тому 0,96 г вуглецю міститься в (0,96 × 100 / 40) = 2,4 г цукрів.

Мальтозний сироп на 43% складається із цукрів, отже для  утворення лікопіну до поживного  середовища потрібно внести (2,4 × 100 / 43) = 5,6 г цього джерела вуглецю.

Враховуючи, що при рості  на вуглеводах близько 40% субстрату  окиснюється до СО₂ для отримання енергії, вміст мальтозного сиропу становитиме ( 5,6 × 0,4) + 5,6 = 7,84 г.

Потреби для синтезу  біомаси

Для синтезу біомаси необхідно 0,96 × 14,7 = 14,1 г/л вуглецю. Така кількість буде міститись у (14,1 × 100 / 40) = 35,25 г цукрів. У перерахунку на мальтозний сироп отримаємо (35,25 × 100 / 43) = 82 г.

40% субстрату втрачається  на холосте окиснення, тому  для одержання 42 г/л біомаси  в середовище потрібно внести ( 82 × 0,4) + 82 = 114,8 г мальтозного сиропу.