Біосинтез лікопіну

5.4.Особливості метаболізму біологічного агенту.

Як уже зазначалася  гриб Blakeslea trispora є хемоорганогетеротрофом, а отже в якості субстратів може використовувати органічні сполуки. Такими сполуками є мальтозний сироп, соєве борошно, кукурудзяний екстракт.

Комплекс синтезованих ферментів  залежить від складу поживного середовища (від джерела вуглецю).

Біосинтез лікопіну при рості  на поживному середовищі, що містить  мальтозний сироп відбувається шляхом катаболізму вуглеводвмісних компонентів  останнього. Основне джерело вуглецю  складається із мальтози та декстрину, які під дією α-глюкозидази та глюкоамілази відповідно перетворюються на глюкозу [36] .

Головним шляхом отримання  енергії для гриба є гліколітичний  шлях Деякі інтермедіати (піруват, малат, оксалоацетат, ізоцитрат) використовуються для синтезу широкого спектру  вторинних метеболітів.

Піровиноградна кислота  є одним з ключових інтермедіатів  метаболізму. В присутності кисню ПВК транспортується в мітохондрії, де пертворюється на Ацетил–КоА. Потім Ацетил-КоА в поєднанні з оксалоацетатом утворює цитрат. У циклі трикарбонових кислот цитрат втрачає 2 молекули СО₂ та знову перетворюється на оксалоацетат.

В результаті катаболізму  цукрів цим шляхом утворюється 38 молекул  АТФ.

Ключовими ферментами гліколізу є 1-Фосфофруктокіназа, та 6-Фосфофруктокіназа.

Субстратом для  утворення каротиноїдів є ацетил-КоА – попередник мевалонової кислоти, яка перетворюється в ізопентилпірофосфат. В результаті багатоступеневої полімеризації останнього через геранілпірофосфат та фарнезілпірофосфат утворюється гераніл-геранілпірофрсфат. Дві молекули геранілгеранілпірофосфату конденсуються з утворенням фітоїну завдяки фітоїнсинтазі. Завершальним етапом синтезу лікопіну  є вплив фітоїндегідрогенази, яка вводить 4 подвійні зв’язки в молекулу фітоїну.

Проміжні сполуки циклу  трикарбонових кислот поповнюються шляхом карбоксилювання фосфоенолпірувату.

 Схема біосинтезу цільового продукту та ферменти, які беруть участь у процесі наведені у додатках 1,2.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

        

Розділ 6. Опис технологічного процесу біосинтезу лікопіну

6.1Розрахунок кількості стадій культивування

Загальний об’єм ферментера для виробничого культивування становить 1 м³. Коефіцієнт заповнення ферментера – 0,6. Виходячи з таких значень можна зробити розрахунок робочого об’єму ферментера. Він обчислюється за формулою V_заг • η = V_роб., і становить 1 • 0,6 = 0,6 м³, або 600 л.

Кількість інокуляту становить 10%, тобто для того, щоб отримати 600 л культуральної рідини потрібно внести 600 • 0,1 = 60 л посівного матеріалу. Враховуючи особливість отримання лікопіну при культивуванні гетероталічного мукорового гриба Blakeslea trispora, потрібно отримати 40 л штаму (-), та 20 л штаму (+).

Накопичення (-) штаму проводиться  у посівному апараті об’ємом 63 л, з коефіцієнтом заповнення 0,65.

(+) штам продуцента вирощують у 40 літровому ферментері з таким же коефіцієнтом заповнення.

 Щоб отримати таку  кількість посівного матеріалу  до апаратів потрібно внести 40 • 0,1 = 4л; та 20 • 0,1 = 2 л (-) та (+) штамів відповідно. 4 л посівного  матеріалу отримують шляхом вирощування  у ферментері об’ємом  6,3 л з коефіцієнтом заповнення 0,65.

2 л культури можна отримати  шляхом вирощування в колбах  об’ємом 750 мл. Колби заповнюють на 50% ( 750/2 = 375 мл), тобто для отримання 2 л потрібно 2000/375 ≈ 6 колб.

Для отримання 4 л посівного  матеріалу потрібно внести 4 • 0,1 = 400 мл культури штаму (-). Таку кількість  отримують в колбах на 250 мл. Готують 4 колби з середовищем.

У зв’язку з тим, що склад поживного середовища для вирощування в колбах відрізняється від того, яке використовують для промислового культивування, культуру (+) штаму також готують у колбах меншого об’єму. Для того. Щоб отримати 2 л посівного матеріалу потрібно внести 2•0,1 = 0,2л, або 200 мл культури.

Кількість посівного матеріалу, яку потрібно внести у такий ферментер становить 6 • 0,1 = 0,6 л або 600 мл. Таку кількість інокуляту можна отримати у колбах на 750 мл, або використати 6 колб на 100 мл.

Кількість стадій, які потрібно виконати подано в табл.6.1

Таблиця 6.1

Кількість стадій культивування

№  Стадії	Об’єм культури, л		Об’єм апарату, л
	(-) штам	(+)штам	(-) штам	(+)штам
1 стадія	0,4	0,2	0,75 (2колби)	0,75
2 стадія	4	2	0,75 (12 колб)	0,75 (6 колб)
3 стадія	40	20	63	32
4 стадія		600	1000

 

 

 

 

 

 

 

 

6.2 Опис технологічного процесу біосинтезу

ДР 1. Санітарна підготовка виробництва.

ДР 1.1. Підготовка персоналу. Ця стадія включає в себе такі операції: навчання персоналу, контроль знань та проведення інструктажу.

ДР 1.1.1 Навчання персоналу. Проводиться обгрунтування основних технологічних процесів, ознайомлення з головними аспектами виробництва. Триває 2 тижні.

ДР 1.1.2 Контроль знань. Відбувається після завершення навчання. Проводиться у формі письмового чи усного іспиту. Результати заносять до спеціальних бланків.

ДР 1.1.3 Інструктаж.

Перед початком роботи персонал проходить інструктаж з техніки  безпеки. Запис про проходження  інструктажу заноситься в спеціальний  журнал. В подальшому інструктаж проводиться 1 раз на квартал з відповідним  записом до журналу.

ДР 1.2 Приготування миючих та дезинфікуючих засобів.

До цієї стадії входить  приготування розчину каустичної соди та приготування хлораміну.

ДР 1.2.1 Приготування розчину каустичної соди.

Для миття обладнання використовують 2% розчин каустичної соди.  Для приготування 1 л такого розчину потрібно взяти наважку 20 г каустичної соди та розчинити її  в 980 мл води, температура якої 75 ⁰С. Час приготування – 20 хв.  Зберігається розчин у скляній чи емальованій тарі, яка повинна щільно закриватися. Подається на ДР 1.4.1

ДР 1.2.2 Приготування хлораміну.

Цей розчин використовують для дезинфекції виробничих приміщень. Готують шляхом розчинення 20 г моно хлораміну у 980 мл води з температурою 40-45 ⁰С. Зберігають не більше 5 діб. Готують для разового застосування. Готовий розчин подається на ДР 1.3.2

ДР 1.3 Підготовка виробничих приміщень. Ця стадія включає щоденне та генеральне прибирання.

ДР 1.3.1 Щоденне  прибирання. Проводять із застосуванням 5% універсального миючого розчину. Цим розчином обробляють підлогу. Підвіконня, стіни, двері обробляють вологою ганчіркою, змоченою у миючий розчин. Особливу увагу приділяють ручкам дверей та їх нижній частині. Після обробки поверхні протирають вологою ганчіркою без миючого розчину.

ДР1.3.2 Генеральне прибирання.  Генеральне прибирання проводять 1 раз на тиждень. Використовують універсальний миючий розчин та розчин хлораміну. Вони подаються від ДР 1.2.1 та ДР 1.2.3 відповідно. Прибирають підлогу, вікна,підвіконня, стіни, двері, стелю, поверхню обладнання.

Обробку приміщень проводять у гумових рукавичках.

ДР 1.4 Підготовка обладнання та комунікацій. Частини або поверхні устаткування, що контактують з продукцією, виготовляються з матеріалів, які не вступають з нею в реакцію, не мають абсорбційних властивостей і не виділяють речовин у такій кількості, щоб це могло вплинути на якість продукції. Ця стадія включає в себе кілька операцій.

ДР 1.4.1 Миття обладнання та комунікацій. Миття обладнання проводять 2%-ним розчином каустичної соди, який надходить від ДР 1.2.2. Розчин пропускається через обладнання та комунікації. Його температура становить 80⁰ С. Тривалість промивання 15-20 хв.

ДР 1.4.2 Ополіскування  обладнання та комунікацій. Ця операція здійснюється шляхом пропускання по трубопроводах водопровідної води з температурою 20 ⁰С. Відпрацьовану воду направляють на знешкодження відходів.

ДР 1.4.3 Перевірка  на герметичність. Перевірку на герметичність здійснюють шляхом подачі до ємкісного обладнання повітря з тиском 0,3

 

МПа. Якщо протягом 30 хв покази манометра не змінилися, то обладнання герметичне. Якщо при нанесенні на поверхню фланцевих з’єднань мильного розчину утворюється піна, то вони – не герметичні. В такому випадку проводять розбір та ущільнення обладнання та комунікацій.

ДР 1.4.4 Стерилізація обладнання Стерилізація обладнання та комунікацій проводиться гострою парою. Технологічні параметри, що підтримуються – тиск та температура. Тиск становить 0,2 МПа, а температура 125-130 ⁰С. Після стерилізації конденсат, що утворився направляють на знешкодження відходів.

ДР 2 Підготовка стерильного технологічного повітря.

ДР 2.1 Забір атмосферного повітря. Атмосферне повітря забирають за допомогою повітрезабірника на висоті 1-2 м над рівнем даху виробничого приміщення, де стабільно низька концентрація мікроорганізмів.

ДР 2.2 Очищення повітря  від пилу та механічних часточок. Отримане атмосферне повітря направляють на фільтри грубого очищення. На таких фільтрах видаляється пісок, пил та інші забруднення. Ступінь очищення повітря становить 80%.

ДР 2.3 Компремування повітря. Після фільтрів грубого очищення повітря потрапляє на турбокомпресор, де стискається до тиску 0,35-0,5 МПа. Потужність компресора та тиск який він створює обирають розрахунково, залежно від необхідності подолання місцевих опорів (фільтри, запірна арматура, вентилі, товщина шару культуральної рідини  в апараті тощо). Стиснення повітря приводить до підвищення його температури до 120 ⁰С, та підвищення вологовмісту. Частина повітря може подаватися на ДР 2.6.

ДР 2.4 Охолодження  повітря. Після компресора повітря охолоджується та направляється на конденсатовловлювач. Щоб забезпечити повну конденсацію вологи повітря переохолоджується до температури 25-40 ⁰С в теплообмінному апараті.Такої температури досягають з використанням холодної води. Вона є оборотною і може бути використана повторно.

ДР.2.5 Стабілізація термодинамічних показників До цієї операції входить пропускання повітря через ресивер, основною функцією якого є зменшення пульсацій потоків повітря в трубопроводі. Тиск повинен становити 0,2 МПа.

ДР. 2.6 Підігрів повітря Після відведення вологи повітря нагрівають до температури 70 – 90 ⁰С. При таких температурах не відбувається конденсація пари на волокнах фільтра. Вологість повітря повинна становити 40 %. Підігрів здійснюють парою. Також можливе часткове підмішування гарячого повітря після компресора з ДР2.3, але при цьому потрібно контролювати значення вологості.

ДР. 2.7 Очищення в головному фільтрі На головному фільтрі очищують повітря для усіх ферментаторів цеху. Ступінь очистки становить 90%. На цьому етапі проводять мікробіологічний контроль. Метод визначення – аспіраційний.

ДР. 2.8. Очищення повітря в індивідуальному фільтрі.  На індивідуальних фільтрах повітря очищується на 99,99 %. Ці фільтри встановлені безпосередньо біля ферментерів. Перед очещенням повітря фільтри необхідно простерилізувати. Найефективнішим способом є нагрівання вологою парою  і витримка впродовж певного часу при температурі 125-130 ⁰С. Після стерилізації фільтрувальний матеріал висушують гарячим повітрям. На цьому етапі здійснюють мікробіологічний контроль за допомогою аспіраційного методу визначення.

ДР 3. Приготування компонентів поживного середовища.

ДР 3.1 Підготовка поживного середовища для вирощування  культури в колбах.

Для вирощування культури  в колбах використовують середовище наступного складу, г/л:

Кукурудзяне борошно  47

Соєве борошно            23

КН₂РО₄                          0,5

Тіамін                              0,002

Приготування 400 мл поживного  середовища для вирощування (-) штаму  культури:

Кукурудзяне борошно:    47 г – 1000мл

                                               х – 400 мл;    х = (47 • 400)/ 1000 = 18,8г

Соєве борошно: 23 г – 1000мл

                                 х – 400 мл;                   х = (40•23)/1000 = 9,2 г

КН₂РО₄   0,5 г – 1000 мл

                     х –400 мл;                               х = (400•0,5) /1000 = 0,2 г

Тіамін: 0,002 г – 1000мл

                     х – 400 мл;                              х = (400•0,002)/1000 = 0,0008 г

 

Приготування 200 мл поживного  середовища для вирощування (+) штаму  культури:

Кукурудзяне борошно:    47 г – 1000мл

                                                х – 200 мл;    х = (47 •  200)/ 1000 = 9,4г

Соєве борошно:  23 г – 1000мл

                                 х – 200 мл;                х = (200•23)/1000 = 4,6 г