Біосинтез лікопіну

КН₂РО₄   0,5 г – 1000 мл

                     х –200 мл;                              х = (200•0,5) /1000 = 0,1 г

Тіамін: 0,002 г – 1000мл

                     х  – 200 мл;                            х = (200•0,002)/1000 = 0,0004 г

 

ДР 3.1.1 Приготування та стерилізація цукровмісних компонентів

Для приготування цукровмісних компонентів беруть наважку 18,8+9,4 = 28,2 г кукурудзяного борошна та 9,2+4,6 = 13,8 г соєвого борошна та подрібнюють  в роторно-пульсаційних апаратах. Отриману суміш переміщують у окрему ємність, та заливають 500 мл води. Ємність ставлять на вогонь та витримують 20 хв, періодично перемішуючи вміст. Після заварювання розчин розливають в 3 колби на 750 мл , тобто по 542/3 = 181 мл в кожну. Вимірюють рН та доводять значення до 6,2-6,8. Колби закривають пробкою та відправляють на стерилізацію в автоклав. Режим стерилізації: t = 120 ⁰С, Р = 0,05 МПа, τ = 40 хв.

ДР 3.1.2 Приготування тав стерилізація розчину мінеральної  солі

Наважку 0,2+0,1 = 0,3 г КН₂РО₄ розчиняють у 57 мл дистильованої води. Розчин розливають у 3 колби на 100 мл ( по 19 мл в кожну), закривають пробками та відправляють на стерилізацію в автоклав. Стерилізація проходить за температури 131 ⁰С, тиску 0,15МПа та триває 60 хвилин.

ДР 3.2 Підготовка поживного середовища для вирощування посівного матеріалу І генерації

На цьому етапі технологічного процесу готують 2 та 4 літри поживного середовища наступного складу, г/л:

Мальтозний сироп                      120;

Кукурудзяний екстракт              60;

 Хлібопекарські дріжджі (сухі)   0,5;

КН₂РО₄                                                                   0,5;

NaCl                                                3;

MnSО₄ 7H₂О                               0,1;

Тіамін                                            0,002;

Загальний об’єм культуральної рідини  для (+) штаму становить 2л, тобто 1,8 л поживного середовища та 0,2 л інокуляту. Для приготування 1,8 літрів середовища потрібно, г:

Мальтозний сироп                      120•1,8 =216 мл;

Кукурудзяний екстракт              60•1,8 = 108 мл;

 Хлібопекарські дріжджі (сухі)   0,5•1,8 = 0,9 г;

КН₂РО₄                                                                   0,5•1,8 = 0,9 г;

NaCl                                                3•1,8 =5,4 г;

MnSО₄ 7H₂О                               0,1•1,8 = 0,18 г;

Тіамін                                            0,002•1,8 = 0,004 г;

Загальний об’єм культуральної рідини  для (-) штаму становить 4л, тобто 3,6 л поживного середовища та 0,4 л інокуляту. Для приготування 3,6 літри середовища потрібно:

Мальтозний сироп                      120•3,6 =432 мл;

Кукурудзяний екстракт              60•3,6 = 216 мл;

 Хлібопекарські дріжджі (сухі)   0,5•3,6 = 1,8 г;

КН₂РО₄                                                                   0,5•3,6 = 1,8 г;

NaCl                                                3•3,6 =10,8 г;

MnSО₄ 7H₂О                               0,1•3,6= 0,36 г;

Тіамін                                            0,002•3,6= 0,0072 г;

ДР 3.2.1 Приготування та стерилізація цукровмісних компонентів

Відміряють 216+432 = 648 мл мальтозного сиропу, 108+216 = 324 мл кукурудзяного екстракту та зважують 1,8+0,9 = 2,7 г сухих хлібопекарських дріжджів. Кукурудзяний екстракт нейтралізують за допомогою СаСО₃. Змішують компоненти в окремі ємності та доливають 4 л води. Перемішують. Потім 4+0,648+0,324+0,0027 = 5 л розподіляють по колбах.

Кількість колб: 12+6 = 18, тобто  в кожну колбу потрібно внести 5/18 = 0,28 л , або 280 мл.Колби закривають пробками та відправляють на стерилізацію в автоклав. Режим стерилізації:  t = 112 ⁰С, Р = 0,05 МПа, τ = 40 хв. Після стерилізації проводять мікробіологічний контроль.

ДР 3.2.2 Приготування та стерилізація розчину мінеральних солей

         Наважку солей: 1,8+0,9=2,7 г КН₂РО₄ , 5,4+10,8=16,2 г NaCl  та 0,18+0,36 = 0,54 г MnSО₄ 7H₂О переносять у колбу. Додають 380 мл води, та за допомогою HCl доводять значення рН до 4,0. Потім отриманий розчин розливають у 18 колб, тобто по 380/18 = 21 мл в кожну. Закривають колби та стерилізують    за температури 131 ⁰С, тиску 0,15МПа. Процес триває 60 хвилин. Після стерилізації рН доводять до 6,2 за допомогою NaOH. Проводять мікробіологічний контроль.

ДР 3.3 Підготовка поживного середовища для вирощування посівного матеріалу ІІ генерації

        Для посівного матеріалу ІІ генерації готують 40 та 20 л ітрів (-) та (+) штамів відповідно. Склад поживного середовища не змінюється.

Загальний об’єм культуральної рідини  для (+) штаму становить 20л, тобто 18 л поживного середовища та 2 л інокуляту

Для приготування 18 літрів середовища потрібно:

Мальтозний сироп                      120•18 =2,16 л;

Кукурудзяний екстракт              60•18 = 1,08 л;

 Хлібопекарські дріжджі (сухі)   0,5•18 = 9 г;

КН₂РО₄                                                                   0,5•18 = 9 г;

NaCl                                                3•18 = 54 г;

MnSО₄ 7H₂О                               0,1•18 = 1,8 г;

Тіамін                                            0,002•18 = 0,036 г;

Загальний об’єм культуральної рідини  для (-) штаму становить 40л, тобто 36 л поживного середовища та 4 л інокуляту

Для приготування 36 літрів середовища потрібно:

Мальтозний сироп                      120•36 =4,32 л;

Кукурудзяний екстракт              60•36 = 2,16 л;

 Хлібопекарські дріжджі (сухі)   0,5•36 = 18 г;

КН₂РО₄                                                                   0,5•36 = 18 г;

NaCl                                                3•36 =108 г;

MnSО₄ 7H₂О                               0,1•36= 3,6 г;

Тіамін                                            0,002•36= 0,072 г;

Для приготування 60 літрів посівного  матеріалу потрібно: 60-6-6 = 48 л води. 6 л – кількість інокуляту; 6 л – конденсат під час стерилізації. З них 16 л потрібно для приготування поживного середовища, на якому росте (+) штам, та 32 л для (-) штаму.

ДР 3.3.1Приготування та стерилізація цукровмісних компонентів

      Відміряють 2,2 л мальтозного сиропу, 1,1 л кукурудзяного екстракту та зважують 9 г сухих хлібопекарських дріжджів. Кукурудзяний екстракт нейтралізують за допомогою СаСО₃. Змішують компоненти в окремі ємності з мішалкою та охолоджувальною сорочкою і доливають 9 л води. Доводять рН до 6,2 та стерилізують гострою парою при увімкненій мішалці. Цукровмісні компоненти для вирощування (-) штаму готують так: відміряють 4,3 л мальтозного сиропу, 2,2 л кукурудзяного екстракту та зважують 18 г хлібопекарських дріжджів. Кукурудзяний екстракт нейтралізують за допомогою СаСО₃. Змішують компоненти в окремі ємності з мішалкою та охолоджувальною сорочкою і доливають 17 л води. Доводять рН до 6,2 та стерилізують гострою парою при увімкненій мішалці.

 Режим стерилізації:  t = 112 ⁰С, Р = 0,05 МПа, τ = 40 хв. Після стерилізації проводять мікробіологічний контроль.

ДР 3.3.2 Приготування та стерилізація розчину мінеральних солей

Солі для (+) штаму: наважку солей: 9 г КН₂РО₄ , 54 г NaCl  та 1,8 г MnSО₄ 7H₂О  переносять у посівний апарат об’ємом 32 л. Додають 16-6-2,2-1,1-0,1 = 6,6 л води, та за допомогою HCl доводять значення рН до 4,0.

Солі для (-) штаму: 18 г КН₂РО₄ , 108 г NaCl  та 3,6 г MnSО₄ 7H₂О  переносять у посівний апарат об’ємом 63 л. Додають 32-17-4,3-2,2-0,18 = 8,5 л води, та за допомогою HCl доводять значення рН до 4,0.

Стерилізують гострою парою   за температури 131 ⁰С, тиску 0,15МПа. Процес триває 60 хвилин. Після стерилізації рН доводять до 6,2 за допомогою NaOH.

ДР 3.4 Підготовка поживного середовища для виробничого  культивування.

Для виробничого культивування  готують 600 – 60 = 540 літрів поживного середовища, де 60 це кількість інокуляту. Кількісний вміст компонентів становить:

Мальтозний сироп                      120•540 =64,8 л;

Кукурудзяний екстракт              60•540= 32 л;

Хлібопекарські дріжджі (сухі)   0,5•540 = 270 г;

КН₂РО₄                                                                   0,5•540 = 270 г;

NaCl                                                3•540 =1,62 кг;

MnSО₄ 7H₂О                               0,1•540= 54 г;

Тіамін                                            0,002•540= 1,08 г;

Соєва  олія                                      24 л

Кількість води, яку потрібно додати: 540 – 60 = 480 л, 60 – конденсат.

ДР 3.4.1Приготування та стерилізація цукровмісних компонентів

          Відміряють 64,8 л мальтозного сиропу,  32 л кукурудзяного екстракту та зважують 270 г сухих хлібопекарських дріжджів. Кукурудзяний екстракт нейтралізують за допомогою СаСО₃. Змішують компоненти у збірнику з мішалкою та охолоджувальною сорочкою та доливають 250 л води. Доводять рН до 6,2 та стерилізують гострою парою при увімкненій мішалці. Режим стерилізації:  t = 112 ⁰С, Р = 0,05 МПа, τ = 40 хв. Після стерилізації проводять мікробіологічний контроль.

ДР 3.4.2 Приготування та стерилізація розчину мінеральних солей

         Наважку солей: 270 г КН₂РО₄ , 1,62 кг NaCl  та  = 54 г MnSО₄ 7H₂О  переносять у виробничий ферментер.  Додають 133 л води. За допомогою HCl доводять значення рН до 4,0. Стерилізують    за температури 131 ⁰С, тиску 0,15МПа. Процес триває 60 хвилин. Після стерилізації рН доводять до 6,2 за допомогою NaOH.

ДР 3.4.3 Стерилізаціясоєвої олії.

Соєву олію стерилізують у окремому апараті за температури 131 ⁰С, тиску 0,15МПа. Процес триває 60 хвилин.

ДР 3.5 Приготування та стерилізація піногасника

В якості піногасника використовують хімічну речовину Basildon. Її стерилізують за температури 131 ⁰С, тиску 0,15МПа. Процес триває 60 хвилин.

ТП 4 Підготовка інокуляту та посівного  матеріалу.

            ТП 4.1 Ведення музейної культури. Музейні культури штаму (-) та (+) штамів зберігають на агаризованому середовищі. Для отримання посівного матеріалу повітряний міцелій та спори вимивали з поверхні агару стерильною водопровідною водою. Отриманими суспензіями засівали колби.

ТП 4.2 Вирощування  посівного матеріалу в колбах.

ТП 4.1.1. Вирощування (-) штаму. Компоненти поживного середовища для культивування в колбах на качалках надходять від ДР 3.1.1, ДР 3.1.2 та ДР 3.1. Перед введенням музейної культури в колбу зі стерильними цукровмісними компонентами вносять простерилізований розчин солі, та охолоджують до температури культивування. До отриманого поживного середовища додають тіамін. Зі скошеного агару висівають музейну культуру (-) штаму продуцента. Вирощування триває 48 годин. Температура процесу – 25-27 ⁰С, кількість обертів ротаційного шейкера – 250 об/хв. Через кожні 8 годин проводять мікробіологічний контроль на наявність сторонньої мікрофлори, якої не повинно бути в середовищі. Після завершення процесу визначають вміст біомаси в середовищі.

ТП 4.1.2. Вирощування (+) штаму. Компоненти поживного середовища для культивування в колбах на качалках надходять від ДР 3.1.1, ДР 3.1.2 та ДР 3.1. Перед введенням музейної культури в колби зі стерильними цукровмісними компонентами вносять простерилізований розчин солі, та охолоджують до температури культивування. До отриманого поживного середовища додають тіамін. Зі скошеного агару висівають музейну культуру (+) штаму продуцента. Вирощування триває 48 годин. Температура процесу – 25-27 ⁰С, кількість обертів ротаційного шейкера – 250 об/хв. Через кожні 8 годин проводять мікробіологічний контроль на наявність сторонньої мікрофлори. Наявність сторонньої мікрофлори не допускається.

ТП 4.3 Вирощування посівного матеріалу І генерації

ТП 4.2.1 Вирощування (-) штаму. Компоненти поживного середовища надходять від  ДР 3.2.1 та  ДР 3.2.2; тіамін з ДР 3.2.  В колби до стерильних цукровмісних компонентів через палаючий факел вносять стерильні розчини солей, додають тіамін та охолоджують до температури культивування. Посівний матеріал надходить із ТП 4.2.1. Вирощування триває 48 годин. Температура процесу становить 27 ⁰С, кількість обертів ротаційного шейкера – 250 об/хв. Через кожні 8 годин проводять мікробіологічний контроль на наявність сторонньої мікрофлори. Після завершення процесу визначають вміст біомаси.

ТП 4.2.2 Вирощування (+) штаму. Компоненти поживного середовища надходять з  ДР 3.2.1 та ДР 3.2.2; тіамін з ДР 3.2. В колби до стерильних цукровмічних компонентів через палаючий факел вносять стерильні розчини солей, додають тіамін та охолоджують до температури культивування.   Посівний матеріал надходить із ТП 4.2.2. Вирощування триває 48 годин. Температура процесу становить 27 ⁰С, кількість обертів ротаційного шейкера – 250 об/хв. Під час процесу кожні 8 годин відбирають проби та проводять мікробіологічний контроль на наявність сторонньої мікрофлори. Після завершення процесу визначають концентрацію біомаси.