Біосинтез лікопіну

Отже загальний вміст  мальтозного сиропу, необхідного  для синтезу біомаси та лікопіну становить 114,8 + 7,84 ≈ 123 г/л.

Рослинні олії.

Аналогічно робимо розрахунок для соєвої олії. Так як для синтезу  біомаси потрібно у (21 / 1,43) = 14,7 разів  більше вуглецю, ніж для утворення  лікопіну, можна зробити запис: 15,7 • х = 7,43 , звідки х = 0,47.

Потреби для синтезу  лікопіну

Для утворення цільового  продукту необхідно внести таку кількість  рослинної олії, в якій міститься 0,47 г вуглецю.

У поживному середовищі рослинні олії можуть бути піногасниками, або  виступати додатковим джерелом вуглецю. При культивуванні Blakeslea trispora в основному використовують соєву олію.

До складу цієї олії входить  декілька жирних кислот, зокрема: лінолева, олеїнова, стеаринова, ліноленова, пальмітинова, арахінова та міристиновва. Кількість  лінолевої кислоти в олії – 57%, отже за нею і будемо проводити  розрахунок. 

Молекулярна маса жирної кислоти  становить 280 г/моль, із них – 216 г  вуглецю, або (216×100)/280 = 77,1 %.

У 100 г кислоти – 77 г  вуглецю, тоді 0,47 г карбону міститься  в (0,47 × 100) / 77 = 0,61 г лінолевої кислоти.

Оскільки її вміст в  соєвому борошні 57%, то для отримання 1,6 г лікопіну потрібно 0,61 / 0,57 = 1,1 г. Так як 40%  субстрату окисненюється  до СО₂ ,  для утворення барвника потрібно (1,1×0,4) +1,1 = 1,54 г.

Потреби для синтезу  біомаси

Для синтезу біомаси потрібно внести 0,47 × 14,7 = 6,9 г вуглецю. Така кількість вуглецю міститься у (6,9×100) / 77 = 8,96 г лінолевої кислоти. У перерахунку на соєву олію отримаємо (8,96 × 100) / 57 = 15,7 г. 40% цього субстрату йде  на «холосте окиснення», отож для синтезу 42 г/л біомаси потрібно: ( 15,7×0,4) + 15,7 = 22 г соєвої олії.

Загальний вміст повинен  становити  1,54+22 = 23,54 г.

Розрахунок вмісту в середовищі джерела азотного живлення

Азот не входить до складу цільового продукту і потрібен в  середовищі лише для внукрішньоклітинних  потреб культури. В заданому поживному  середовищі  джерелом азоту є  кукурудзяний екстракт. Він містить 4,5% азоту, однак з них засвоюється  лише 3%.

Біомаса культури на 10% складається  з азоту, отже у 42 г біомаси  42/10 = 4,2 г азоту. Для того, щоб забезпечити  таку кількість необхідно (4,2×100) /3 = 140 г екстракту.

Розрахунок кількості  фосфору в середовищі

 Біомаса продуцента  лікопіну містить приблизно 3% фосфору. Для синтезу 42 г/л біомаси  в середовище необхідно внести 42×0,03 = 1,26 г фосфору. Джерелом цього  елементу є двозаміщений фосфат  калію. Молекулярна маса солі  становить 136 г/моль. Вміст фосфору  в солі – 31 г. Отже 1,26 г фосфору  міститься у (136×1,26)/31 = 5,5 г/л даної солі.

Розрахунок складу підживлюваного розчину

Загальний вміст мальтозного  сиропу 123 г/л, а соєвої олії – 22,54 г/л. Тобто маса джерел вуглецю становить 123 + 23,54 = 146,54 г/л.Таку кількість не можна  вносити одразу, оскільки буде спостерігатися пригнічення або повне припинення росту, тому застосовують дробне внесення вуглецевого субстрату.

Початкова концентрація  соєвої олії та цукрів мальтозного  сиропу не повинна перевищувати 40 г/л.

У 123 г/л сиропу – ( 123 × 43) / 100 = 52,9 г цукрів.

Цукрів мальтозного сиропу в середовищі у 52,9 / 23,54 = 2,25 рази більше, ніж соєвої олії. Приймаємо, що кількість  соєвої олії становить 1, тоді мальтозного  сиропу – 2,25.

Тобто можна записати: 3,25 • х = 40, звідки х = 12,3.

Початковий вміст соєвої олії становить 12,3 г/л, а мальтозного сиропу – 12,3 × 2,25 = 27,68 г/л. В перерахунку на мальтозний сироп отримаємо (27,68 × 100) / 43 = 64,37 г/Л.

Тривалість культивування  становить 120 годин. Припустимо, що підживлення  додається через кожні 12 годин. Тоді кількість порцій становить (120-12)/12 = 9. З кожною порцією підживлення  в середовище необхідно вносити  (23,54 – 12,3) / 9 = 1,25 г/л соєвої олії та (123 – 64,37) / 9 = 6,51 г/л мальтозного сиропу.

До середовища також вносяться  тіамін, сухі хлібопекарські дріжджі, рослинні олії та солі NaCl і MnSO₄•H₂O.

Наведені розрахунки можна  подати у вигляді таблиці. (Табл. 4.1)

 

Таблиця 4.1

Склад поживного середовища для культивування продуцента лікопіну      

Компоненти	Вміст г/л
	Сумарний	Початковий	У підживлювальному розчині	В одній порції підживлення
Мальтозний сироп	123	64,4	58,6	6,5
Соєва олія	23,54	12,3	11,2	1,25
Кукурудзяний екстракт	140	140
КН2РО4	5,5	5,5

Виходячи з розрахунку можна зробити висновок, що поживне  середовище, яке використовується для  культивування гетероталічного  мукорового гриба Blakeslea trispora  відрізняється від теоретично можливого. У експериментальному середовищі вміст деяких компонентів нижчий: кукурудзяного екстракту вносять 60 г/л, а теоретично потрібно 140 г/л; КН₂РО₄ – 0,5 г/л, а згідно теоретичних розрахунків – 5,5 г/л. Разом з тим теоретично можливий вміст соєвої олії (23,54 г/л) нижчий від експериментального ( 50 г/л). Це пов’язано з особливостями посівного матеріалу, а також з умовами культивування.

4.4 Обгрунтування способу проведення біосинтезу

При культивуванні мікроорганізмів  слід підібрати такі режими, при  яких вихід цільового продукту буде максимальним. На міцеліальні культури значно впливають надлишкові зрізові  зусилля. Для оптимізації процесу  культивування слід підібрати таку інтенсивність перемішування, яка  б забезпечувала макимальний  ступінь масообміну та насичення  киснем поживного середовища. Водночас необхідно стежити за тим, щоб  перемішуючий пристрій апарату не розривав міцелій культури. Для культивування Blakeslea trispora ці умови забезпечуються при інтенсивності перемішувавння 200 об/хв [11]. Асептичність біосинтезу потрібно забезпечувати з метою усунення ризику контамінації цільового продукту сторонньою мікрофлорою. Лікопін не синтезується в організмі людини, і тому потрапляє разом з продуктами харчування. Антиоксидант, який виготовлено шляхом мікробного синтезу активно використовують як органічний барвник. Якщо останній буде уражений сторонньою мікрофлорою, то вона потрапить і у продукт який обробляють. Потрапивши до організму людини такий продукт не лише не принесе користі, а й може завдати шкоди. Тому асептичність процесу є однією з необхідних умов, яка піддається жорсткому контролю на всіх стадіях виробнитцтва.

Ферментація здійснюється періодичним  способом. В процесі культивування  з періодичним завантаженням  окрім поживних речовин, які входять  до складу середовища, додатково вводять  компоненти для живлення ферментаційної системи. Один чи більше компонентів  додають під час культивування, таким чином доповнюючи поживні речовини, які спожиті під час ферментації. Перевагою використання такої системи є змога уникнути високих концентрацій поживних речовин, таких як цукри та солі амонію. Ще однією перевагою є можливість продовжити ферментацію після того, як один із компонентів буде повністю використаний шляхом додаткового підживлення. Застосування процесу з періодичним завантаженням дозволяє отримати  високу концентрацію біомаси та продукту. Ще однією причиною культивування періодичним способом є використання (-) та (+) штамів продуцента.

Процес ферментації проводять  глибинним способом. Цей спосіб дозволяє збільшити вихід цільового продукту, за рахунок уникнення так званих «голодних зон». Застосування обладнання для перемішування дало змогу  створити динамічні системи глибинного культивування з отриманням гомогенної культури [25] .

 4.5 Обгрунтування вибору ферментаційного обладнання

Основною ланкою технологічного процесу в біотехнології є обладнання. Від його якості та  продуктивності залежить тривалість та інтенсивність процесу [26] .

Біореактор повинен бути сконструйований так, щоб виключити  можливість потрапляння сторонньої мікрофлори, а також забезпечити  збереження потрібних мікроорганізмів  [27] .

Міцеліальні культури мають певні особливості культивування. У зв’язку з негативним впливом надлишкових зрізових зусиль вони потребують м’яких умов вирощування.

Апарати, що забезпечують такі вимоги  можуть бути оснащені системою перемішування у вигляді пружних  циліндричних сильфонів, які відповідають висоті циркуляційної обичайки. Такі ферментери мають гофровану поверхню по гвинтовій лінії [27] .

Однак, такий апарат не дозволяє отримати достатньо гомогенну систему, адже можуть утворюватися застійні зони. Крім того в результаті відсутності  м’якого технологічного режиму культивування внаслідок багаторазового контакту суспензії з елементами конструкції руйнується міцелій культури [27] .

Культивування клітин рослинного та тваринного походження відбувається в біореакторах, які мають  корпус з кришкою, перемішувальний пристрій та патрубки для підведення поживного середовища та відбору біомаси. Система перемішування складається із  нерухомої перевернутої склянки з вертикальними прорізами в стінці, та конусоподібними отворами у дні.

Така конструкція є  причиною розвитку руйнування міцелію, а також приводить до падіння  ефективності процесу перемішування, зменшуючи продуктивність [27] .

Ємнісний апарат для вирощування  міцеліальних форм мікроорганізмів  має корпус, систему завантаження та перемішування у вигляді ротора шнекового типу з приводом. У верхній  частині ємності вмонтована направляюча  воронка [27] .

Недоліком такого апарату  низький рівень перемішування у  верхній частині апарату, що приводить  до недостатньої гомогенізації системи.

Біореактор, який використовують в промисловості для культивування  міцеліальних форм мікроорганізмів  оснащені системою перемішування у  вигляді ротора шнекового типу з  приводом; корпусом, виконаним із двох частин. У верхній частині робочої ємності встановлений направляючий апарат, нижня частина являє собою параболоїд обертання, який з’єднаний з дугоподібною верхньою частиною корпуса. На кришці для завантаження компонентів вмонтовані технологічні патрубки, та патрубок для відведення готового продукту. Направляючий апарат складається із діаметрально протилежних лопаток, встановлених під кутом  від 15 до 20 ⁰ до вертикальної площини, та під кутом 70-75⁰ до горизонтальної площини. Всередині такого апарату знаходяться планки, які можуть змінювати форму шляхом вигину у вертикальніій площині.

Такий апарат дає змогу  збільшити ступінь перемішування  багатофазних систем при мінімальній  частоті обертання ротора, що забезпечує покращення якості готового продукту, та зниження енергозатрат. Це пов’язано з тим, що відбувається безперервне перемішування у верхній частині корпуса при мінімальній затраті часу на на циркуляцію потоку рідини.

На Рис.1 представлено зображення апарату для вирощування міцеліальних форм; Рис.2 – розріз А-А; Рис.3 –направляючий апарат; [27]

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Рис.1 Апарат для вирощування міцеліальних форм мікроорганізмів

1. Корпус
2. Ротор шнекового типу
3. Вертикальний вал
4. Шків
5. Підшипниковий вузол
6. Патрубок для відводу суспензії
7. Кришка апарату
8. Технологічні патрубки
9. Направляючі планки
10. Направляючий апарат

         

 

Рис.2 Розріз А-А                                   Рис. 3 Направляючий апарат

4.6Аналітичний огляд способів і методів реалізації мети виробництва

Виробництво барвника та антиоксиданту лікопіну можна розділити на такі етапи: санітарна підготовка виробництва, підготовка стерильного технологічного повітря, підготовка та стерилізація поживного середовища, підготовка інокуляту і посівного матеріалу та виробничий біосинтез. Кожен з цих етапів включає низку технологічних операцій, що забезпечують виготовлення продукції.

Дана технологічна схема  є графічним зображенням  найефективнішого технологічного процесу виробництва. Вона не потребує значних витрат промислових  ресурсів.

           Санітарна підготовка виробництва. Цей етап технологічного процесу включає в себе такі стадії: підготовка персоналу, підготовка миючих та дезинфікуючих розчинів, підготовка виробничих приміщень, а також обладнання та комунікацій. Він потрібний для забезпечення необхідного рівня асептичності процесу, а отже і для отримання якісного цільового продукту; для охорони здоров’я працівників; для створення безпечних умов виробництва.

 Підготовка персоналу  є необхідним етапом, адже для  забезпечення нормальних умов  виробництва насамперед потрібні  висококваліфіковані фахівці, які  мають досвід роботи в даній  галузі та ознайомлені з інформацією  про кожен етап процесу. Вони  повинні володіти такими якостями  як відповідальність і точність, повинні вміти швидко приймати  рішення в критичних умовах. Фактично  від рівня знань працівників  в даній галузі залежить весь  технологічний процес.