Цитоскелет

Замены аминокислотных остатков в N-концевом сегменте полипептидной  цепи существенно влияют на общий  заряд молекулы, изменяя изоточку актина в интервале рН 5,4 - 5,5. Существует по крайней мере 6 изоформ актина. Данные о первичной структуре актина высших растений, полученные на основании анализа нуклеотидных последовательностей актиновых генов, указывают на то, что вариабельность актина растений значительно выше, чем вариабельность актина животных. В частности, изоактины сои содержат 35 - 45 замен. В целом, актины растений отличаются от актинов животных 55 - 65 аминокислотными остатками. В актинах растений замены затрагивают значительное число заряженных остатков, поэтому их изоточки могут различаться почти на единицу (рН 5,1 - 5,8).

 

2.2. Актин-связывающие  белки.

Этим названием объединяют группу белков, способных взаимодействовать с актином. Они очень многочисленны и разнообразны. В зависимости от выполняемых ими функций, актин-связывающие белки подразделяют на несколько групп.

 

• Белки, ингибирующие полимеризацию актина.

Белки этой группы связываются  с мономерным актином и препятствуют его полимеризации. К ним относятся:

1. Профиллины - это сходные по свойствам, но различные по первичной структуре белки небольшого молекулярного веса (12,5 - 16 кД), широко распространенные в эукариотических клетках. Профиллины связываются с мономерным актином в соотношении 1:1. Во взаимодействии участвует С-концевой участок актина и С-конец профиллина. Образующийся при этом комплекс (профилактин) характеризуется резко уменьшенной способностью к полимеризации. На взаимодействие профиллина и актина влияет ряд факторов - изоформа актина, присутствие ионов магния, кальция, калия могут сильно менять прочность профилактинового комплекса. Профилактин может быть диссоциирован фосфолипидами. Это объясняется тем, что профиллин, кроме актина, способен реагировать также с фосфолипидами, а оба сайта связывания находятся в одном и том же С-концевом участке молекулы профиллина. Наиболее эффективно связывается с профиллином фосфатидилинозитол-4,5-бифосфат (PIP2) один из ключевых участников фосфатидилинозитольного пути передачи сигнала с поверхности клетки.
2. Фермент поджелудочной железы - ДНКаза I - образует очень прочный комплекс с G-актином. При этом теряется как активность ДНКазы, так и способность актина к полимеризации. ДНКаза I может также связываться с F-актином и индуцировать его деполимеризацию. При взаимодействии актина с ДНКазой I ингибируется не только способность актина к полимеризации , но и способность ДНКазы I гидролизовать ДНК. Это позволило разработать удобный метод определения количества мономерного актина в клетке. Кроме того, комплекс актина с ДНКазой I был успешно использован для кристаллизации и изучения трехмерной структуры актина. Однако физиологическая роль взаимодействия G-актина с ДНКазой I не ясна.
3. Тимозин бета-4. Это небольшой белок выделен из тромбоцитов. Как и профиллины, он связывается с G-актином и ингибирует его полимеризацию. Высокое содержание тимозина бета-4 обнаружено в тромбоцитах и макрофагах. Так же, как профилин и белок, связывающий витамин Д, тимозин бета-4 поддерживают уровень глобулярного актина, играя роль буфера. Предполагается также, что освобождение тимозина из комплекса с актином и появление его в плазме крови может быть сигналом, запускающим иммунную систему клетки

 

• Белки, кэпирующие актиновые филаменты.

Белки этого типа названы  так потому, что они присоединяются к одному из концов актинового филамента  и блокируют как полимеризацию, так и деполимеризацию актина на этом конце. Большинство кэпирующих белков связывается с оперенным концом актинового филамента. Некоторые белки реагируют с острым его концом. К белкам, связывающимся с оперенным концом актинового филамента, относятся: гельзолин и его сывороточная форма - бревин, а также виллин, фрагмин и северин. Белками, кэпирующими острые концы актиновых филаментов, являются, например, акументин из макрофагов с молекулярной массой 65 кД и бета-актинин, выделенный из клеток мышц и почек.

Большинство из этих белков взаимодействует с «быстрым» концом нити. Их можно разделить на 3 группы: гельзолин/виллин, фрагмин/северин и белки, которые называются просто кэпирующими белками. Содержание кэпирующих белков в клетке примерно на два порядка ниже, чем содержание актина, т.е. ни нить актина приходится одна молекула кэпирующего белка. Большинство из кэпирующих белков взаимодействует с N-концевым сегментом актиновой нити (единственным известным исключение является С-концевая часть гельзолина). Некоторые из них содержат много основных аминокислотных остатков, что позволяет предложить пространственный механизм взаимодействия этих белков с актином.

Белки, взаимодействующие с "медленным" концом актиновой нити, изучены хуже. К ним относятся акументин и бета-актинин. Кроме того, способностью блокировать "медленный" конец обладает комплекс спектрина с белком 4.1 из эритроцитов. Существует также группа кэпирующих низкомолекулярных белков, которые связывают G-актин и режут нити. По-видимому, функцией этих белков является деполимеризация нитей актина в процессе перестройки актиновых структур в клетке.

 

• Стабилизирующие белки.

Основными белками, стабилизирующими актиновые филаменты, являются тропомиозины. Это близкородственная группа белков, присутствующая в сократительном аппарате всех клеток. Она получила свое название благодаря тропомиозину мышц - первому известному члену этой группы. Тропомиозин мышц состоит из двух субъединиц по 33 кД (284 аминокислоты). Димер представляет собой палочковидную структуру, длиной около 40 нм.

Тропомиозин взаимодействует с  латеральной частью актинового филамента. При этом молекулы тропомиозина соединяются друг с другом конец в конец, образуя две сплошные продольные нити в бороздках актинового филамента. Имеется множество изоформ тропомиозина, экспрессирующихся тканеспецифическим образом. Они различаются по молекулярному весу (от 30 до 40 кД) и изоэлектрической точке. Все множество изоформ в высших эукариотах образуется из, по крайней мере, 4 генов. Каждый из генов кодирует несколько изоформ посредством альтернативных промоторов или альтернативного сплайсинга.    Связывание тропомиозина с актиновыми филаментами стабилизирует их, предотвращая их спонтанную фрагментацию, но не разрезание гельзолином. Тропомиозин участвует во взаимодействии актина со спектрином, обеспечивающее формирование двумерной сети примембранного цитоскелета, как и другие белки, обладающие спектринсвязывающей активностью: аддуцин, тропомодулин, дематин.

 

• Белки, сшивающие актиновые филаменты.

Белки, образующие сшивки между филаментами актина, способствуют образованию разнообразных трехмерных суперструктур актина. Среди них можно выделить несколько групп.

1. Глобулярные белки.

Представители этой группы являются наиболее низкомолекулярными из всех актин-связывающих белков, способных делать сшивки между актиновыми филаментами. Они представляют собой глобулярные мономерные молекулы. Взаимодействие этих белков с нитями F-актина in vitro приводит к образованию плотных пучков актиновых филаментов, поэтому их еще называют пучкующими белками.

К глобулярным сшивающим белкам относятся фасцин (58 кД), выделенный из яиц морского ежа, фимбрин (68 кД), виллин (92 кД), синапсин I, калпактины, полоса 4.9 из мембраны эритроцитов, белок 55 кД из клеток HeLa, родственный ему белок 52 кД из Physarum polycephalum и другие. Пучки актиновых филаментов, образованные с помощью фасцина, имеют вид паракристаллов, имеющих поперечную исчерченность с периодичностью 10 нм. В пучках же, образованных с помощью белков 55 кД и 52 кД, исчерченность отсутствует. Пучкующий белок ABP-50 из Dictyostelium discoideum одновременно является фактором элонгации 1-альфа. 

 

2. Палочковидные белки.

Из белков этой группы наиболее распространены альфа-актинины, которые встречаются как в мышечных, так и в немышечных клетках. Молекула альфа-актинина связывается с филаментами актина своими концами, образуя жесткий поперечный мостик. В результате такого взаимодействия образуется трехмерная сеть актиновых филаментов, в составе которой могут обнаруживаться как параллельно, так и беспорядочно ориентированные филаменты. С альфа-актининами очень сходен белок актиногелин из клеток HeLa. Сшивать актиновые филаменты в пучки кальций- кальмодулин -зависимым образом способен также белок аддуцин - димерная молекула из двух похожих субъединиц (100 кД и 105 кД).

 

3. Нитевидные белки.

Высокомолекулярные актин-связывающие  белки, образующие длинные гибкие сшивки между актиновыми филаментами, можно  разделить на два семейства. Это филамино-подобные белки и спектрино-подобные белки. При взаимодействии этих белков с F-актином in vitro происходит образование изотропного геля, в составе которого актиновые нити образуют беспорядочно организованную трехмерную сеть.

Филамино-подобные белки, к которым  относится филамин из гладких мышц, актин-связывающие белки из макрофагов и ряд других иммунологически родственных белков, состоят из двух длинных гибких субъединиц с М.м. 250-270 кД, соединенных встык. Концы такого димера могут взаимодействовать с нитями актина, образуя между ними сшивки.

Спектрино-подобные белки получили свое название от основного белка  мембранного цитоскелета эритроцитов - спектрина. Неэритроидные спектрины выделены из многих других типов клеток. Их часто называют фодринами по названию белка, выделенного из мозга. Спектрины состоят из двух типов субъединиц - альфа и бета, которые, располагаясь антипараллельно, образуют гетеродимер длиной около 100 нм. Молекула спектрина обычно представляет собой тетрамер длиной около 200 нм, полученный за счет ассоциации двух гетеродимеров, хотя могут образовываться и более сложные олигомеры. У животных имеется несколько изоформ альфа- и бета-субъединиц, которые характеризуются тканеспецифическим расположением. Молекулярная масса альфа-субъединиц составляет 240 кД, а бета-субъединиц - варьирует от 220 до 260 кД.

Каждый гетеродимер спектрина  на конце содержит один участок связывания актина. Таким образом, тетрамер и  более высокомолекулярные олигомеры  способны образовывать сшивки между актиновыми филаментами. Эффективность связывания спектрина с актином существенно повышается в присутствии белка 4.1 из мембраны эритроцитов или сходных с ним белков из других типов клеток. Связывание спектрина с актином усиливает также белок аддуцин, причем этот эффект ингибируется кальмодулином в зависимости от кальция.

4. Другие сшивающие белки.

Помимо описанных выше белков способностью связывать друг с другом актиновые филаменты  обладает ассоциированный с микротрубочками  белок MAP2.

 

 

 

 

• Регуляторные белки.

Кальдесмон выделен  их гладкомышечных клеток, но обнаруживается также во многих немышечных клетках. Изоформы кальдесмона различаются  в разных тканях и у разных видов. Кальдесмон - высоко асимметричная удлиненная молекула с молекулярной массой около 93 кД. Ее длина составляет 74-90 нм. Центральный домен молекулы представляет собой довольно жесткий стержень длиной 30-40 нм, тогда как концы по 20 нм каждый способны легко изгибаться. Кальдесмон связывается латерально с актиновым филаментом, захватывая 14 актиновых мономеров и две молекулы тропомиозина . Две параллельные цепи кальдесмона ассоциированы с двумя бороздками актинового полимера так, что их концы разделены промежутком в 7 мономеров актина.

Основная функция кальдесмона - регуляторная. Для осуществления этой функции кальдесмон связывается с кальмодулином кальций-зависимым образом. Кальмодулин-связывающие участки расположены на гибких концах молекулы. При связывании с актином кальдесмон ингибирует активируемую актином АТФазу миозина. Как актин-связывающая, так и ингибиторная активности локализованы на C-конце молекулы кальдесмона. N-конец кальдесмона связывается с миозином. Описан еще ряд кислых Са-связывающих белков, взаимодействующих с кальдесмоном и необходимых для его функционирования.

 

• Белки, связывающие актин с мембраной.

Группой родственных  белков, способных непосредственно  привязывать актиновые филаменты к фосфолипидам мембраны, являются калпактины, обнаруженные во многих типах клеток. Эти белки имеют участки связывания ионов кальция, могут фосфорилироваться тирозиновой протеинкиназой pp60src. Аналогичным образом ассоциация актиновых филаментов с внутренней стороной мембраны, по-видимому, может осуществляться кэпирующим белком гельзолином, поскольку кроме актина гельзолин может взаимодействовать с полифосфоинозитидами, расположенными в мембране.

Миозины I также способны связываться с мембранными липидами и привязывать актин к мембране. В микроворсинках щеточной каемки кишечного эпителия миозин I связывается с мембраной в комплексе с кальмодулином. Связь кальмодулин-миозинового комплекса с мембраной, как и с актином, разрушается при добавлении ATP .

Ассоциация актина с различными белками мембраны, как правило, осуществляется через ряд посредников. При этом непосредственно с актином связывается тот или иной из известных актин-связывающих белков, после чего актин в комплексе с таким белком прикрепляется к интегральному мембранному белку, обычно с помощью дополнительных посредников. Выделяют такие комплексы как:

Прикрепление актин-спектринового комплекса,

Прикрепление актин-филаминового комплекса,

Прикрепление актин-альфа-актининового комплекса.

 

2.3. Миозин.

Миозины - это класс актин-связывающих белков, ответственных за различные формы подвижности актин-содержащих систем. Эти белки очень разнообразны по структуре и свойствам. Они объединяются в одну группу благодаря наличию общего "головного" домена, обладающего АТФазной активностью, которая стимулируется при связывании миозина с актином. Миозины очень разнообразны по структуре и свойствам. Их разнообразие определяется структурой и свойствами С-концевого участка или хвостового домена. В настоящее время все миозины разделяют на два больших класса - миозины типа I и миозины типа II .

2.3.1. Миозин II.

Наиболее хорошо изученным представителем миозинов типа II является миозин скелетных мышц. Молекула этого белка состоит из трех пар полипептидных цепей - пары тяжелых цепей по 200 кД и двух пар легких цепей (по 20 кД и по 16 кД). Тяжелая субъединица содержит два основных домена - глобулярный (головка) и альфа-спиральный (хвост). Две тяжелых субъединицы ассоциируют друг с другом так, что головки направлены в одну сторону, а хвосты спирально закручиваются друг относительно друга. Легкие цепи (по одной из каждой пары) связываются с головкой тяжелой субъединицы, как правило, вблизи ее соединения с хвостом.