Цитоскелет

Функция придатков  точно не определена. Предполагается, что они способствуют взаимодействию центриоли с плазматической мембраной  при формировании базального тельца; вероятно, что также может существовать связь и с другими мембранными органеллами. Наличие придатков зависит от фазы клеточного цикла и от типа клетки. Так материнские центриоли в клетках культуры СПЭВ содержат придатки на всех стадиях, включая  G0-период. А в гепатоцитах мыши материнские центриоли имеют придатки только в G1, при продвижении по циклу они утрачиваются; клетки интактной печени придатков не формируют.

Другой отличительной  особенностью материнской центриоли  является наличие сателлитов; в зарубежной  литературе чаще употребляется термин субдистальные придатки. От придатков они отличаются бóльшей вариабельностью в размерах, числе и расположении. Сателлиты состоят из конусовидных поперечно-полосатых оснований и небольших круглых головок; на одну центриоль приходится 1-5 подобных образований. В отличие от придатков, сателлит прикрепляется одновременно к 2-3 триплетам. Показано, что сателлиты являются центром организации микротрубочек. Интересно, что придатки и сателлиты присутствуют у одних и тех же центриолей – материнских. Биохимическим маркером созревания центриоли является белок ценексин, который присутствует только в зрелой  материнской центриоли.

В настоящее  время  выделяют следующие функции  центриолей:

— репликация центриолей;

— образование материнской центриолью первичной реснички;

— организация  перицентриолярного материала; в отсутствие центриолей центросома не формируется; однако, с другой стороны, в литературе описаны и данные  о существовании бесцентриолярной центросомы в клетках. Согласно последней точке зрения все центросомы можно разделить на две группы: центриолярные (имеющие в своем составе центриоль) и бесцентриолярные (центросомы, в которых центриоль отсутствует).

В перицентриолярном  материале располагаются так  называемые "затравки" микротрубочек, имеющие вид колец и спиралей диаметром около 30 нм. Непосредственно к ним и прикрепляются микротрубочки. "Затравки", по-видимому, могут входить в состав микротрубочек при полимеризации. "Затравки" часто расположены кластерами, получившими название центры нуклеации микротрубочек (ЦНМТ). ЦНМТ могут быть как прикрепленными к центриолярному цилиндру через ножки сателлитов (и тогда они называются головками сателлитов), так и свободными. В последнем случае они получили название фокусов схождения микротрубочек. Кроме того, в области клеточного центра обнаруживаются плотные "вирусоподобные частицы" (ВПЧ); функция их пока не известна. В постсинтетическом периоде интерфазы сателлиты исчезают; одновременно с этим процессом появляется фибриллярное гало – центр образования микротрубочек веретена деления .

Таким образом, совокупность структур, принимающих участие в формировании микротрубочек на протяжении всего клеточного цикла, получила название центросома. В ней выделяют две основные составные части: центриоли и перицентриолярный материал, организованный в митозе в виде гало, а в интерфазе в форме сателлитов, ЦНМТ, центросомного матрикса и перицентриолярных придатков. Окружающие центросому микротрубочки, а также располагающиеся в этой зоне везикулы, образуют центросферу.

Не смотря на то, что центриоли характерны для большинства изученных клеток, их присутствие в составе центросомы не является облигатным.  В связи  с этим особое внимание хотелось бы уделить функциям центросомы. Наиболее важной функцией центросомы является формирование разных категорий микротрубочек в течение клеточного цикла. То есть центросома является основным центром организации микротрубочек (ЦОМТ) в клетке. Так, в интерфазе центросома образует цитоплазматические микротрубочки, участвующие в распределении органелл и создании полярности клетки, организовывая, таким образом, направленный транспорт. При вступлении клетки в митоз центросома формирует микротрубочки веретена деления. Кроме того, центросома инициирует рост микротрубочек, образующих стенку центриоли.

 

 

5.2. Биохимические особенности центриоли и центросомы.

В настоящее  время в связи с развитием  методов молекулярной биологии всё  бóльший интерес вызывает белковая природа центросомы. На данный момент выделено достаточно большое  количество белков, предложены способы их классификации. Однако, следует заметить, что пока не было обнаружено ни одного белка, который всегда присутствовал только в центросоме.  Мы рассмотрим лишь некоторые, наиболее важные, из них:

1) γ-тубулин  – один из постоянных компонентов центросомы, является белком "затравки"

2) Перицентрин  – структурный белок перицентриолярного  материала, участвует в пространственном  расположении остальных участников  сборки микротрубочек; при микроинъекции  антител происходят нарушения  в формировании веретена деления, и даже наблюдается его отсутствие.

3) Центрин  (кальтрактин) – основной белок  исчерченных корешков, обнаружен  также в сателлитах и перицентриолярном  матриксе; принимает участие в  дупликации центриолей; Ca²⁺-связывающий белок.

4) Моторные  белки – осуществляют транспорт  по микротрубочкам.

5) р210 – белок,  связывающийся с придатками центриолей, он играет роль во взаимодействии  с плазматической мембраной.

6) PCM-1 – белок, локализующийся на сателлитах, при помощи динеина участвует в прикреплении цитоплазматических микротрубочек в течение интерфазы.

7) С-Nap1 – белок, специфически связывающийся через киназу Nek2 с проксимальными концами двух центриолей, объединяя их таким образом в интерфазе.

 

5.3. Нарушения в строении и функционировании центросомы.

Роль центросомы в формировании злокачественных  опухолей.

Итак, главной  функцией центросомы является формирование интерфазных и митотических микротрубочек.  Как уже упоминалось, центросома принимает активное участие в  образовании веретена деления, а, значит, и в передвижениях хромосом во время митоза. Можно предположить, что структурные изменения этой органеллы приведут к неравномерному распределению хромосом между дочерними клетками после цитокинеза. Такая гипотеза была высказана ещё в 1914 году Теодором Бовери (Boveri) при изучении атипичного эмбрионального развития морского ежа и анализе структуры опухолевых клеток.

 Исследования, проводимые в настоящее время,  подтверждают эту идею. Аномальное  строение центросом было выявлено  в опухолях дыхательных путей, легких, простаты, толстого кишечника, поджелудочной и молочных желез. Центросомные нарушения, обнаруживаемые в клетках, имеющих злокачественный фенотип, можно разделить на 3 группы. К первым относятся собственно изменения в структурной организации центросомы. В частности, было показано увеличение общего объёма центросомы, а также увеличение длины центриолярного цилиндра. Такие дефекты в строении центриолярного цилиндра как: уменьшение числа микротрубочек, С-форма центриоли и увеличение длины были обнаружены и при атеросклерозе сосудов.

Вторая группа нарушений связана с изменениями  на биохимическом уровне. Так, в опухолях дыхательных путей был выявлен  повышенный уровень фосфорилирования центрина, что в норме характерно только для митотических клеток. Кроме того, в опухолях отмечен и высокий уровень γ-тубулина.

Выявлено, что  возникновение центросомных аномалий связано с присутствием в центросоме некоторых регуляторных молекул, в  частности белков семейства aurora/Ipl-like kinase. Многие из этих киназ колокализованы с центросомой, участвуя в дупликации центросом, их созревании и движении, необходимых для правильной сегрегации генома. Повышенная экспрессия серин-треониновых киназ aurora выявлена в ряде опухолевых клеточных линий и отмечена их способность индуцировать амплификацию центросом.

Отличительными  особенностями трансформированных клеток во всех наблюдаемых типах  рака были: наличие избыточного перицентриолярного материала и множественность  центриолей. Они и составляют третью группу выявляемых нарушений. Часто в таких клетках обнаруживается атипичное веретено деления, нарушения в сегрегации хромосом и анеуплоидия.

Хотелось  бы также обратить внимание на тот  факт, что нарушения в строении центросомы были выявлены не только в  опухолевых клетках, но и на более ранних стадиях развития злокачественного фенотипа, например, в аденомах. Подтверждением этого служит тот факт, что онкопротеин Е7 папилломовируса человека HPV-16 индуцирует аномальный синтез центросом на ранних стадиях развития злокачественного фенотипа, нарушая при этом экспрессию cdk2. Амплификация центросомы может увеличивать и метастатический потенциал вследствие изменений в системе цитоскелета, что и находит отражение в тканевой архитектуре.

Сопоставление имеющихся данных подтверждает ранее высказанную гипотезу: аномалии центросомы, приводящие к возникновению дефектов веретена деления, вызывают неправильную сегрегацию хромосом и способствуют развитию анеуплоидии. Это приводит к накоплению мутаций в клеточной популяции и, как следствие, к формированию опухоли. Нарушения в размере и числе центросом в опухолевых клетках коррелируют с уровнем нестабильности хромосом, а также с частотой патологических митозов. При этом частота патологических митозов приблизительно в три раза выше в опухолях, где наиболее часто встречаемой патологией является увеличение перицентриолярного материала (по сравнению со всеми другими нарушениями центросом).

Кроме того, во многих злокачественных опухолях человека выявлена инактивация таких регуляторных элементов G1-S-перехода, как Rb-белок и р53, а также повышенная экспрессия циклинов D и E, cdk 4 и 6, ингибиторов cdk p16^INK4A и p15^INK4B  .

Таким образом, нарушения в структуре и числе  центросом в клетке могут быть важным диагностическим и/или прогностическим  признаком малигнизации ткани. Это предполагает изучение центросомы в качестве одной из мишеней раковой терапии.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

6. Препараты и ЭМФ.

 

6.1. Цитоскелет.

1. Цитоскелет в первичных фибробластах. Препарат.

Окраска Кумасси бриллиантовым  синим. Относится к группе проционовых красителей. Их молекулы состоят из активной части (дихлортиазинового кольца, специфически реагирующего с аминогруппами белков) и хромофобной части, обусловливающей цвет красителя. Белки пробы взаимодействуют с сульфогруппами красителей, образуя комплекс белок-краситель, интенсивность окраски которого пропорциональна концентрации белка в исследуемом растворе. Основной недостаток этой группы методов заключается в различной способности разных белков связывать краситель.

Для того, чтобы получить этот препарат, необходимо сначала  убрать мембранные структуры. Для этого клетки обрабатывают хелатонами, например, тритоном. На препарате видны прямые нити по краям – это стресс-фибриллы.

На фотографии (световая фазово-контрастная  микроскопия) представлен первичный мышиный фибробласт (живой).

 

2. Цитоскелет в фибробласте. ЭМФ.

Для создания этого препарата  сначала также убирают мембранные структуры. Затем получают платиновую реплику (метод напыления). Далее препарат опускаем в плавиковую кислоту, которая растворяет стекло. Полученные тонкие (10-15Å) пленки напыления «ловятся» на бледны для электронной микроскопии.

• Цитоскелет в фибробласте. Ведущий край клетки.

На фотографии видна область фокального контакта. Вследствие небольшого увеличения определить тип филаментов цитоскелета невозможно, но очень хорошо видно, что они образуют сеть.

 

• Цитоскелет в фибробласте. Околоядерная зона.

На фотографии видны белки ламины, актиновые филаменты и α-актинин.

 

• Цитоскелет в фибробласте. Участок цитоплазмы.

Хорошо прослеживаются все три компонента цитоскелета

 

3. Иммунофлуорисценция промежуточных филаментов.

 

4. Промежуточные филаменты. ЭМФ.

На ЭМФ представлены 2 типа промежуточных  филаментов: белки ламины и филаменты, расположенные в цитоплазме.

 

5. Актиновые филаменты. Ведущий край клетки.ЭМФ.

 

6. Строение саркомера. ЭМФ,

 

7. Иммунофлуоресценция актиновых микрофиламентов в фибробласте кожи человека.

 

8. Иммунофлуоресценция тропомиозиновых микрофиламентов в фибробласте кожи человека.

 

9. Иммунофлуоресценция миозиновых микрофиламентов в фибробласте кожи человека.

 

10. Микротрубочки. Метод фазового контраста. Иммунофлуорисценция – α-тубулин.

 

11. Поляризованный движущийся фибробласт.

На фото: красным цветом окрашены микрофиламенты, связанные с антителами к актину; зеленым – микротрубочки, окрашенные антителами к α-тубулину

 

 

6.2. Центросома  и центриоль.

 

1. Клетка культуры ткани в S-G2-периоде.

Иммунофлуорисцентное окрашивание антителами к γ-тубулину.