Цитоскелет

Аналогичный белок был вскоре обнаружен в других типах клеток. Кинезины из разных источников очень сходны между собой по иммунологическим свойствам и по структуре молекулы. Кинезин является гетеродимером, состоящим из двух тяжелых (110-130 кД) и двух легких (58-70 кД) цепей. Молекула кинезина имеет удлиненную форму с двумя глобулярными головками на одном конце и вееровидным расширением на другом Кинезин является АТФазой, активность которой сильно стимулируется микротрубочками. Сайты связывания АТФ и сайты связывания микротрубочек расположены на глобулярной головке тяжелой цепи.

Методами негативного  контрастирования и кругового оттенения  платиной было показано, что молекула кинезина имеет форму стержня  диаметром 2 - 4 нм и длиной 80 - 100 нм с двумя глобулярными головками на одном конце и веерообразным расширением на другом. В середине стержня находится шарнирный участок, в котором молекула может изгибаться. С помощью декорирования антителами с последующей электронной микроскопией было показано, что легкие цепи локализованы в веерообразном утолщении. Связывание антител с глобулярными головками подавляет транслокаторную активность кинезина. На основании этих данных было сделано предположение, что глобулярные головки содержат участок связывания с микротрубочками. Такое предположение подтверждается также данными молекулярно - генетического анализа, которые показали, что делеция N-концевого участка тяжелой цепи приводила к потере способности к связыванию с микротрубочками. Более того, экспрессированный in vitro N- концевой фрагмент тяжелой цепи размером около 50 кДа обладал механохимической активностью. Этот фрагмент был назван моторным доменом кинезина.

Предполагается, что генерация  движения с помощью кинезина аналогична механохимическому циклу в актомиозиновой системе. Кинезин в культивируемых клетках существует как в растворимом, так и в связанном с мембранами виде. Кинезин в клетках ассоциирован с митохондриями, окаймленными пузырьками, синоптическими везикулами, но не связан с аппаратом Гольджи и ядерной мембраной.

Помимо кинезина существует целое семейство кинезиноподобных белков. Их общим свойством является наличие домена размером около 50 кДа, имеющего высокий процент гомологии с моторным доменом кинезина. Вне моторного домена последовательности кинезиноподобных белков уникальны и не имеют гомологии с другими известными транслокаторами. Кроме того, моторный домен может располагаться у кинезиноподобных белков как на N-конце, так и на С-конце.

Несмотря на многочисленные свидетельства транслокаторной активности кинезина in vitro, его функции in vivo до последнего времени не были прямо подтверждены. Первое экспериментальное свидетельство о функциях кинезина в клетках как антероградного транслокатора было получено в работе В.И.Родионова с соавторами в 1991 г. Авторы данной работы получили поликлональные антитела к моторному домену\Кинезин тяжелой цепи молекулы кинезина. Эти антитела ингибировали функции кинезина in vitro и узнавали кинезин из самых различных объектов. Оказалось, что при микроинъекции антител к кинезину в меланофоры рыб происходит полное подавление транспорта пигментных гранул к периферии клетки без нарушения их транспорта к центру. Почти одновременно другая группа авторов получила сходные данные для мышиных макрофагов. При введении в эти клетки антител к кинезину, обладающих аналогичными свойствами, наблюдалось нарушение

способности тубулярных лизосом вытягиваться вдоль микротрубочек.

 

3.3.2. Динеиноподобные  белки.

Отличительной особенностью динеинов является их способность специфически расщепляться под действием ультрафиолета в присутствии ванадата. Эта реакция часто используется для идентификации динеинов. Механизм генерации силы при взаимодействии динеина и микротрубочки, по-видимому, очень сходен с таковым при актомиозиновом взаимодействии и включает в себя циклические процессы ассоциации-диссоциации динеина с микротрубочками, сопряженные с процессами связывания, гидролиза и высвобождения продуктов. В настоящее время выделяют два класса динеинов - аксонемные динеины и цитоплазматические динеины.

Характерным свойством  динеина является его способность  расщепляться под действием ультрафиолетового  облучения в присутствии АТР, магния и солей ортованадата на два фрагмента с молекулярными массами порядка 240 и 180 кДа. Изменение ионных условий приводит к изменению характера такого расщепления. На этом свойстве основаны методы исследования структуры динеина и функций динеина.

 

• Аксонемные динеины.

Этот класс белков первоначально  был обнаружен в аксонемах жгутиков и ресничек, где динеины образуют "ручки", ассоциированные с дублетом микротрубочек. Аксонемные динеины осуществляют скольжение соседних наружных дублетов микротрубочек, что приводит к биению жгутиков или ресничек. Лучше всего изучены динеины наружных ручек из ресничек тетрагимены, жгутиков хламидомонады и жгутиков сперматозоидов морского ежа.

Эти динеины содержат три типа полипептидных цепей - тяжелые, промежуточные и легкие. Количество цепей варьирует у разных животных. Молекулярный вес тяжелых цепей составляет 400-500 кД, промежуточных -60 -120 кД, легких - 10-40 кД, а общий вес динеина - 1250-2000 кД. Морфологически динеины наружных ручек содержат 2 или 3 глобулярных домена (соответственно числу тяжелых цепей), которые с помощью тонких нитей соединяются друг с другом наподобие букета в области корешкообразного основания. Промежуточные цепи располагаются именно в области этого основания. На каждой головке динеина имеется по одному сайту связывания с микротрубочками (А-микротрубочкой). Связывание головок с микротрубочками чувствительно к АТФ и разрушается при его добавлении. Динеин является АТФазой, активность которой стимулируется микротрубочками. Участки связывания и гидролиза АТФ также расположены на головках динеиновой молекулы

 

• Цитоплазматические динеины.

Цитоплазматический динеин впервые описан в 1987 г. Оказалось, что  известный ранее белок МАР 1С из препарата высокомолекулярных МАР по ряду признаков (коэфффициент седиментации 20S, субъединичный состав, характер расщепления при ультрафиолетовом облучении в присутствии ванадата и АТР, транслокаторная активность) совпадает с препаратом аксонемного динеина ресничек и жгутиков. Было предложено назвать этот белок цитоплазматическим динеином.

Цитоплазматический динеин является ретроградным транслокатором, в отличие от кинезина способным использовать только энергию АТР, но не других NТР. Его транслокаторная активность ингибируется АМР-РNР, ванадатом и азидом натрия.

Цитоплазматический динеин относится к двухголовым динеинам. МАР1С содержит две неидентичные тяжелые цепи (по 400 кД), три промежуточные (74, 59 и 57 кД) и четыре легкие цепи. Морфологически МАР1С состоит из двух глобулярных головок, соединенных парой стебельков. Как и другие динеины, МАР1С обладает активируемой микротрубочками АТФазной активностью. При очистке цитоплазматического динеина из нервных тканей одновременно с ним очищаются и полипептиды 150 и 45 кДа. Эти полипептиды, видимо, являются кофакторами, необходимыми для транслокаторной активности белка, общими для динеина и кинезина.

Хотя все данные свидетельствуют  в пользу того, что цитоплазматический динеин in vivo индуцирует движение частиц в ретроградном направлении, данный факт нуждается в прямом экспериментальном подтверждении.

 

3.4.  Антимитотические  агенты.

Антимитотические  агенты – вещества, которые способны блокировать клетки в митозе.

• Колхицин. Молекулы колхицина прочно связываются с молекулами тубулина (образуя эквимолярный комплекс) и препятствуют тем самым их поляризации. Обработка делящихся клеток колхицином вызывает через несколько минут исчезновение веретена деления и блокирует клетки в митозе.
• Колцемид. Производное колхицина. Также как и колхицин, прочно связывается с тубулином и препятствует его полимеризации.
• Нокодазол не является производным колхицина, но принцип его действия такой же.
• Таксол. Растительный алкалоид из тиса. Таксол прочно связывается с МТ и стабилизирует их. Таксол связывается по сайту, который расположен рядом с ГТФ-связывающим сайтом. 
• Винбластин и винкристин. Относится к винкаалкалоидам. Эти вещества связываются с другим, чем колхицин, участком молекулы тубулина. Как и колхицин, винкаалкалоиды эффективны с субстехиометрических концентрациях. Отличительной особенностью винкаалкалоидов является их способность индуцировать образование тубулиновых паракристаллов в цитоплазме.

 

4. Процесс распластывания.

4.1. Стадии распластывания.

Морфология  распластывания детально изучена на примере нормальных фибробластов (культура клеток). Эти исследования позволили  выделить несколько стадий распластывания и поляризации.

 На стадии начального прикрепления клетка соприкасается с подложкой нижней поверхностью, при этом выростов плазматической мембраны не обнаруживается. В районе контакта клетки с субстратом мембрана уплощена  повторяет форму субстрата; в целом такие клетки мало отличаются от суспендированных. Затем мембрана образует пузыревидные выпячивания вытянутой формы, приподнятые над субстратом на 1-2 мкм. От нижней поверхности таких почек отходят 1-2 микроворсиники. Уже через несколько минут после контакта с субстратом клетка начинает образовывать псевдоподии, которые либо прикрепляются в к подложке, либо вновь втягиваются внутрь.

Принято выделять несколько разных типов псевдоподий:

― филоподии  – цилиндрические псевдоподии  диаметром 0,3,-0,52 мкм;

― ламеллоподии – уплощенные псевдоподии шириной 2-5 мкм;

― лобоподии  - большие отростки диаметром 1-2 мкм;

― рафлы –  большие складки на верхней поверхности.

Таким образом, через 0,5 часа после посадки фибробластов на субстрат они имеют небольшие  размеры, выпуклый центр и отростчатую периферию.

Следующая стадия распластывания – радиальная – по разным данным занимает от нескольких минут до трех часов. На этой стадии центральная часть клетки уплощается, наружный край клетки по-прежнему активен. В начальной стадии распластывания наиболее частыми являются филоподии, прикрепленные к подложке своими концами, затем ламеллоподии, прикрепленные в нескольких точках, и рафлы. При этом преобладание различных типов псевдоподий  зависит от специфичности используемой культуры клеток. Например, для фибробластов хомяка характерны ламеллоподиии, а для фибробластов мыши – филоподии.

Началом третьей  стадии – стадии поляризации – принято считать появление выраженной неравномерности распластывания. Часть клеточного края теряет ламеллярную цитоплазму, а часть края, напротив, содержит обширные ламеллярные выросты. На начальной стадии распластывании клетка приобретает форму неправильного многоугольника или форму звезды. Постепенно часть выростов втягивается и исчезает, число направлений распластывания сокращается до 2-4-х. В клетке появляются стабильные и активные участки клеточного края. Клетки приобретают веретеновидную форму.

 

4.2. Распластывание. МТ и ПФ.

Процесс распластывания сопровождается ростом МТ из центра в  периферические участки клетки. На мышиных эмбриональных фибробластах была детально прослежена перестройка системы МТ в процессе распластывания.

  На ранних  стадиях в филоподиях и формирующейся  ламеллярной цитоплазме МТ отсутствуют.  В более распластанных клетках  одиночные МТ выходят из околоядерной  области и направляются в ламеллу.  В клетках с хорошо развитой ламеллярной цитоплазмой, на радиальной стадии распластывания, МТ формируют кольцевой пучок, идущий вдоль клеточного края. Кольцо может располагаться как вдоль самой границы клетки, входя в ламеллу, так и несколько отступя от клеточного края. Сам кольцевой пучок образован дистальными концами МТ, выходящими из околоядерной зоны. На разных расстояниях Мт поворачивают и идут параллельно краю. Вероятно, в состав пучка входят также МТ, не связанные с клеточным центром.

Следует отметить, что формирование и прикрепление псевдоподий при распластывании клеток происходит с непременным участием актиновых микрофиламентов. МТ для этого процесса не обязательным. Начальные этапы распластывания вплоть до радиальной стадии идут и при разрушении МТ. МТ  начинают играть ведущую роль  лишь на последней стадии распластывания, определяя поляризованную форму клетки.

В суспендированных фибробластах мыши ПФ сконцентрированы в перинуклеарной области цитоплазмы.  При распластывании центральная  сфера  постепенно уменьшается, на ранних стадиях из нее выходят пучки ПФ, на поздних стадиях – отдельные ПФ. Перераспределение ПФ происходит вдоль МТ, приблизительно через два часа после пересадки клеток.

 

 

 

5. Клеточный  центр.

 

5.1. Структура  и функции центриолей и центросомы.

Обычно в  клетке обнаруживаются 2 центриоли, в  течение интерфазы локализованные в околоядерной области. Существенные различия в строении позволили разделить  их на 2 типа: материнскую и дочернюю центриоли. Дочерняя центриоль, как  правило, ни придатков, ни сателлитов не имеет. 2/3 её внутреннего объёма занимает осевая структура, от которой по направлению к микротрубочкам отходят радиальные элементы. Такое образование получило название "ось со спицами" и располагается  в проксимальном и среднем отделах центриоли. Осевой элемент, не имеющий радиальных образований – втулка, может обнаруживаться внутри дистальной и средней частей центриоли.

 Характерной  особенностью материнской центриоли  является наличие на дистальном  конце придатков. На поперечных  срезах они видны как длинные выросты диаметром около 100нм, отходящие от каждого триплета под углом 60º к боковой поверхности и 45º к оси цилиндра. К настоящему времени доказано, что придатки связаны с В-микротрубочкой  триплета и направлены в противоположную от оси закручивания сторону. На концах придатков всегда выделяются электроноплотные гранулы.