Цитоскелет

Главная функция стержневой части  миозина - сборка молекул миозина  при физиологических значениях  ионной силы в хорошо упорядоченные  биполярные филаменты. В центре филамента  молекулы миозина агрегируют биполярно, "хвост к хвосту", а головки смотрят в разные стороны, в результате образуется "голая зона", не несущая головок. По обе стороны от "голой зоны" молекулы миозина упакованы полярно, "хвост к голове", со сдвигом в 43 нм между сосудними молекулами. Остов филамента образован стержневыми частями молекулы миозина, а головки выступают наружу в виде "поперечных мостиков", регулярно расположенных на поверхности филамента и способных вступать во взаимодействие с актиновыми филаментами.

C головками связаны главные  свойства миозина: АТРазная активность и способность взаимодействовать с актином. Головки соединены со стержневой частью миозина гибким "шарнирным" участком и поэтому имеют высокую подвижность относительно стержневой части. В молекуле миозина головки имеют грушевидную форму. Толщина их в широкой части оценивается в 5 - 7 нм, а длина - в 19 - 21 нм.

В каждой головке молекулы миозина  с тяжелой цепью ассоциированы  две разные легкие цепи (LC): "щелочная" (или "существенная") и "регуляторная". Укоренившееся в литературе название " существенные LC " для щелочных LC связано с тем, что до начала 1980-х годов LC этого класса удавалось отделить от миозина лишь в жестких условиях, например, в присутствии мочевины, гуанидина-HCl или при рН 11 (отсюда название "щелочные LC"), что всегда приводило к необратимой потере миозином его главных свойств.

Каждая головка миозина  несет один активный центр миозиновой АТРазы . АТРазная активность (способность гидролизовать АТР до АДР) впервые была обнаружена у миозина более 50 лет назад В.А.Энгельгардом и М.Н.Любимовой. АТРазная активность миозина проявляется только в присутствии определенных катионов. In vitro АТРаза миозина сильно активируется ионами Са++ ( Са++ - АТРазная активность) и очень слабо - ионами Mg++ . Однако Mg++ - АТРазная активность миозина резко возрастает при взаимодействии миозина с актином, это так называемая актинактивируемая Mg++ - АТРазная активность миозина. Только такая активность и имеет место в живой мышце, где в физиологических условиях концентрация Mg++ высока. Кроме того, в отсутствие двухвалентных катионов (в присутствии ЭДТА) АТРаза миозина активируется одновалентными катионами в высоких концентрациях (так называемая ЭДТА - АТРазная активность), причем степень активации зависит от ионного радиуса катиона: наибольшие значения ЭДТА - АТРазной активности наблюдаются в присутствии катионов K+, NH4+, и Rb+ (ионные радиусы 1,33, 1,43 и 1,48 ангстрем соответственно), и максимальная активность - в случае катионов аммония. Катионы с меньшими или большими радиусами (Li+, Na+, Cs+ с ионными радиусами 0,6, 0,98 и 1,69 ангстрем соответственно) неспособны активировать ЭДТА-АТРазу миозина.

2.3.2. Миозин I.

Миозины типа I  характеризуются  еще большим полиморфизмом, чем  миозины II. В отличие от миозинов II с двумя головками и фибриллярным хвостом, они содержат только одну головку  и имеют очень короткий нефибриллярный хвост. Кроме того, они не способны полимеризоваться. Впервые миозин I был выделен из Acanthamoeba castellanii. Он состоит из одной тяжелой и одной легкой полипептидных цепей. Для активации миозина I необходимо фосфорилирование его головного домена, которое осуществляется специфической киназой. Кроме основного актин-связывающего участка на головном домене, миозин I содержит также дополнительный актин-связывающий сайт на хвосте молекулы. Благодаря наличию этого сайта, миозин I может сшивать актиновые филаменты в гель. Связывание актина головным сайтом чувствительно к АТФ, а хвостовым - нет. Существует три изоформы миозина I: Миозин IA, Миозин IB, Миозин IC.

 В высших организмах миозин типа I представлен комплексом белка 110кД. Впервые он был обнаружен в щеточной каемке и почечных эпителиев. Впоследствии аналогичный белковый комплекс был обнаружен и в других типах тканей, не имеющих щеточной каемки - в печени, поджелудочной железе, мозге. В клетках печени кроме миозина I с молеклярной массой 110 кД, имеется более тяжелая изоформа - 130 кД.

Миозины I способны связываться  с мембранами, освобожденными от периферических белков, и с кислыми фосфолипидами. Связывание с фосфолипидами имеет электростатическую природу и опосредовано сильно заряженным участком на хвосте молекулы. В клетках миозины I, как правило, тоже обнаруживаются вблизи мембран, как плазматической, так и мембранных органелл. В условиях in vitro миозины I, как и миозины II, способны перемещать актиновые филаменты по субстрату.

2.3.3. Регуляция актомиозинового  взаимодействия.

В скелетных мышцах регуляция осуществляется на уровне актиновых филаментов с помощью белка тропонина и тропомиозина. Тропонин - комплекс из трех полипептидов: тропонина T , тропонина I и тропонина C (кальций - связывающий). Тропонины C и I образуют глобулярную головку, а T длинный хвост. Тропонин I присоединяется к актину при образовании комплекса с тропонином T и тропомиозином. Образование комплекса препятствует образованию комплекса актина с миозином даже в присутствии кальция. Если к этому комплексу добавить тропонин C построение актин-тропонинового комплекса завершится и актин-миозиновые взаимодействия становятся чувствительными к ионам кальция.

В гладкомышечных и немышечных клетках регуляторный белок кальдесмон, находясь в ассоциации с актином, ингибирует способность последнего активировать магний- АТФазу миозина. При наличии связанного с кальцием кальмодулина кальдесмон отделяется от актинового филамента и его блокирующее действие прекращается.

Следует отметить, что кальций может влиять на процесс сокращения и более сложным способом, меняя супрамолекулярную организацию актиновых филаментов. Это связано с тем, что при повышении концентрации кальция активируются многие режущие белки и происходит отсоединение некоторых сшивающих белков. Образующийся при этом слегка разжиженный гель, как было показано в специальных экспериментах, подвергается более интенсивному сокращению, чем плотный.

В немышечных и гладкомышечных клетках регуляция актомиозинового взаимодействия происходит, в основном, посредством фосфорилирования миозина. Молекула миозина имеет несколько сайтов фосфорилирования. Однако регуляторное значение четко показано в настоящее время лишь для сайта, расположенного на одной из легких цепей миозина (регуляторной). Фосфорилирование этого сайта осуществляется специальным ферментом - киназой легкой цепи миозина - MLCK. MLCK сама по себе также является регулируемым ферментом. Она приобретает активность только в присутствии кальмодулина, связанного с кальцием. Фосфорилирование регуляторной легкой цепи миозина приводит к нескольким последствиям.

Во-первых, происходит конформационное  изменение миозина. Если у нефосфорилированного миозина хвост обычно имеет форму  петли, то у фосфорилированного хвост  выпрямлен. Во-вторых, фосфорилирование стимулирует полимеризацию гладкомышечного и немышечного миозинов. В-третьих, происходит значительное повышение активности активируемой актином Mg2+- АТФазы миозина.

3. Микротрубочки  (МТ).

3.1. Полимеризация  тубулина. Динамическая нестабильность.

Сборка молекул тубулина напоминает полимеризацию актина. Она самопроизвольно  протекает in vitro и сопровождается гидролизом одной молекулы связанного нуклеотида на каждый присоединенный мономер (нуклеотид в случае сборки тубулина – не ATP, а  GTP). МТ из выделенного тубулина демонстрируют так называемую динамическую нестабильность,   это означает, что одни концы МТ удлиняются, тогда как другие укорачиваются. Переход от фазы роста к фазе разборки является быстрым и случайным.

С усовершенствованием техники  прижизненных наблюдений стало возможно исследовать динамику МТ непосредственно  в живых клетках. В клетках динамическая нестабильность несколько усложняется наличием пауз - периодов, когда длина МТ не меняется. Поэтому для описания поведения МТ in vivo рассматривают несколько состояний плюс-концов - рост, укорочение (катастрофу), паузу и переходы между ними.

Процесс полимеризации тубулина включает стадии нуклеации и элонгации. Лимитирующей стадией полимеризации является нуклеация. Природа затравок для  полимеризации тубулина точно не определена. По-видимому, затравки представляют собой несколько коротких, латерально агрегировавших протофиламентов. Элонгация происходит за счет роста протофиламентов, причем разные протофиламенты не всегда растут с одинаковой скоростью.

3.2. Белки, ассоциированные  с МТ.

MAP – microtubule association protein. Или БАМ – белки, ассоциированные с МТ. Наиболее хорошо изучен набор MAP, выделенный из мозга. Эти белки соочищаются с микротрубочками при многократных циклах полимеризации- деполимеризации. Имеется три группы МАР из мозга - высокомолекулярные MAP1 (300-350 кД) и MAP2 (270-285 кД) и низкомолекулярная группа Тау (55-62 кД). Распространение МАР из мозга в других тканях варьирует. Например, МАР2 имеет очень ограниченное распространение, тогда как МАР1А встречается во многих типах клеток.

• МАР2.

Этот белок исследован наиболее подробно, благодаря тому, что он устойчив к нагреванию до 100 град. С и легко может быть отделен от МАР1. МАР2 - не индивидуальный белок; он состоит из двух близких по молекулярной массе и по иммунологическим свойствам белков - MAP2A и MAP2B . Молекулы МАР2 имеют сильно вытянутую форму. Их ассоциация с МТ осуществляется посредством небольшого концевого фрагмента с молекулярной массой около 35 кД. Этот участок очень сходен с соответствующим (связывающимся с микротрубочкой) доменом белка тау. Остальная часть молекулы образует тонкий нитевидный вырост длиной 80-100 нм на поверхности МТ. МАР2, как и другие типы МАР, способствует полимеризации микротрубочек in vitro. Кроме того, МАР2 стабилизирует МТ. Все эти свойства МАР2 (связывание с микротрубочками, стабилизация их, облегчение полимеризации) в значительной степени утрачиваются при фосфорилировании белка. Способностью облегчать полимеризацию МТ и стабилизировать их обладает также фрагмент МАР2, ассоциирующий с МТ. Есть данные о том, что МАР2 способен связывать микротрубочки с актиновыми  и промежуточными филаментами, органеллами и микротрубочки друг с другом. МАР-2 участвует в регуляции движения органелл по микротрубочкам, вероятно, стерически препятствуя взаимодействию транслокаторов со стенкой микротрубочки.

• МАР1.

МАР1 состоит по крайней  мере из 3 высокомолекулярных полипептидов - MAP1A , MAP1B и MAP1C. Ни один из трех белков не обладает термостабильностью. Компоненты МАР1 не родственны иммунологически ни МАР2, ни друг другу. По-видимому, эти белки, в отличие от МАР2, структурно и функционально не связаны друг с другом. В пользу этого свидетельствует также тот факт, что МАР1А и МАР1В, в отличие от МАР1С, высоко чувствительны к протеазам. Как и МАР2, МАР1 образует выросты на стенке микротрубочки.

МАР1 стабилизирует микротрубочки  и способствует их полимеризации  аналогично тому, как это делает МАР2. Недавно было обнаружено функциональное значение компонента МАР1С - он оказался ретроградным транслокатором, т.е. белком, способным перемещаться по микротрубочкам от "+"-конца к "-"-концу.

• Тау.

Это наименее изученная группа ассоциированных с микротрубочками белков из мозга. Она содержит более 20 родственных белков. При ассоциации Тау с МТ выросты не образуются. Стабилизирующие и полимеризующие свойства Тау аналогичны таковым МАР1 и МАР2.

3.3. Белки-транслокаторы.

Белки-транслокаторы - белки, осуществляющие движение транспортных пузырьков по филаментам цитоскелета. К отличительной особенности белков этой группы относится свойство преобразовывать энергию АТР в механическое усилие, способное перемещать частицы вдоль микротрубочек или микротрубочки вдоль субстрата. Соответственно, транслокаторы являются механохимическими АТРазами, и их АТРазная активность стимулируется микротрубочками. В отличие от структурных МАР, транслокаторы ассоциированы с микротрубочками только в момент АТР-зависимого перемещения. Они находятся в основном в свободном состоянии в растворе или ассоциированы с мембранными органеллами и частицами. Однако в присутствии негидролизуемых аналогов АТР или в отсутствие свободных нуклеотидов транслокаторы образуют прочный комплекс с микротрубочками и на этом свойстве основаны первоначальные методы их биохимической очистки из экстрактов тканей.

Белки-транслокаторы  делятся на две группы: кинезиноподобные белки и динеиноподобные белки. Их главным функциональным отличием является способность в тестах in vitro опосредовать движение частиц по микротрубочкам в противоположные стороны - от минус-конца к плюс-концу для кинезина и от плюс-конца к минус-концу для динеина. В клетке это соответствует движениям от центра и к центру или антероградно и ретроградно соответственно. Недавно был обнаружен еще один белок, относящийся к группе транслокаторов - динамин. Этот белок способен образовывать пучки микротрубочек в отсутствие свободного нуклеотида и индуцировать скольжение микротрубочек в пучке в присутствии GTP или, несколько хуже, в присутствии АТР. Полярность опосредуемого динамином движения пока не изучена.

3.3.1. Кинезиноподобные  белки.

Первый транслокатор этого типа был выявлен в гигантском аксоне кальмара. Авторы обнаружили, что в присутствии негидролизуемого аналога АТР, АМР-PNP, в препарате микротрубочек из аксоплазмы появляется минорный белок с молекулярной массой около 120 кДа. При добавлении избытка АТР этот белок экстрагируется с микротрубочек, а в экстракте появляется так называемая транслокаторная активность - при добавлении экстракта к смеси микротрубочек и латекса частицы латекса начинают перемещаться по поверхности микротрубочек. Микротрубочки, в свою очередь, способны перемещаться по поверхности стекла с преадсорбированным на нем экстрактом, содержащим транслокатор.