Генетичні дослідження

Найбільш обширна і  вивчена група моногенних захворювань  – це ензимопатії. Як відомо, всі  біохімічні процеси у живих організмів знаходяться під генетичним контролем. Окремий біохімічний процес складається із цілої серії послідовних реакцій, кожна з яких контролюється окремим ферментом. Будь-який з генів, відповідальних за утворення ферментів, може піддаватися мутації, в результаті якої фермент або змінює свою структуру і функціональні властивості, або зовсім не утворюється, і тоді реакція, що протікає при його участі, блокується. Блок може виникнути в будь-який із ланок ланцюга біохімічної реакції. В результаті такого блоку може мати місце:

- недостатнє утворення  продуктів даної реакції і  більш віддалених продуктів його  перетворення;

- нагромадження в організмі  субстрату блокованої реакції  або його попередників;

- зміни основного напряму  в перебігу реакції і підвищене утворення продуктів, які в нормі є в незначних кількостях.

Класичний прояв біохімічних  мутацій у людини не завжди пов’язаний з первинним ефектом дії генів. Як правило, розвиваються супутні вторинні порушення хімізму і функції тканин, які інколи по яскравості патологічних проявів виступають навіть на передній план. Це явище відоме в генетиці, як множинний ефект або плейтропізм генів. Вторинні зміни не базуються безпосередньо на дефекті гена і не пов’язані із структурними змінами білка. Вони винятково є результатом зсуву обміну речовини, який настає під впливом первинного порушення, і може розповсюджуватись на декілька біохімічних реакцій в різних тканинах, набуваючи різноманітних проявів в залежності від специфіки цих тканин. Так, при фенілкетонурії відсутність ферменту, який розщеплює фенілаланін до тирозину, приводить до нагромадження фенілаланіну в тканинах і перетворення його в токсичні для нервової системи кислоти. Це веде до розумової відсталості дитини. Недостатня кількість проміжних продуктів нормального обміну тирозину призводить до зменшення утворення адреналіну і меланіну і виявляється у дітей в зменшенні пігментації, артеріальної гіпотонії. Діагностичне значення плейотропії полягає в тому, що клінічно встановлений симптом є важливим показником інших, перш за все прихованих патологічних проявів.

1. Аутосомно-домінантний тип успадкування: передача від батьків до дітей по вертикалі, пенетрантність – фенотипичні прояви у носія патологічного гену, і експресивність патологічного гену (ступінь вираженості ознак).

Приклади:

- нейрофіброматоз Рекленгаузена, 

- синдром Морфана, 

- синдром Аперта,

- синдром Франческлетті. 

При повній пенетрантності ризик для сібсів пробанда 50%.

Н

♂ ♀

Аа х аа

Аа аа Аа аа

Н

Н

2. Аутосомно-рецесивний тип успадкування: батьки фенотипово здорові.

♂ ♀

Аа х Аа а - ген хвороби /МВ

МВ МВ АА Аа Аа аа – хворі 25%

здорові Аа (гетерозиготи)

25% 50% (носії) 

Приклади МВ, більшість  захворювань обміну речовин (ензимопатії), фенілкетонурія, лейкодистрофії, нейроліпідози, тощо, синдром МПВР – Секкеля, Меккеля.

3. Х-зчеплені – домінантні - фосфат-діабет,

- рецесивні – гемофілія,  дальтонізм, Х-зчеплений 

імунодефіцит.

ХХ ХY

ХХ ХХ Хy Xy

25% 25% здорові хворі

здорові жінки носії жінки хлопці хлопці

4. Моногенні захворювання з неуточненим типом успадкування: синдром Росела-Сільвестра, синдром обличчя Ельфа.

ІІІ. Мультифакторіальні захворювання. До таких хвороб відносяться всі гіпертензії (6-8 генів), сімейну гіперхолестеринемію (6 генів), порушення імунітету (32 гени), цукровий діабет (8 генів, пара з яких рецисивні), тромбози (6 генів), бронхолегеневі хвороби (6 генів), шизофренія, епілепсія, депресивні синдроми (6-8 генів), дефекти обміну речовин (від 2 до 10 генів), ішемічна хвороба серця, ожиріння.

Подібно до того, як спадковість  людини різноманітна за своєю організацією і функціями, численні її патологічні варіації. В основі різноманітності реакції людини на зовнішні фактори лежить генетичний поліморфізм, коли одна і таж ознака може детермінуватись різними генами, різними алелями одного гена. Коли хвороба викликається багатьма факторами зовнішнього середовища, поліморфізм виражений ще більше. Хвороби із спадковою схильністю і визначаються поєднанням спадкових і зовнішніх факторів, що дозволяє віднести їх до захворювань з пенетрантністю, яка в значній мірі залежна від усіх умов середовища. Поєднане вивчення каріотипу людини, фізичних і фізіологічних особливостей організму, біохімічні дослідження в сукупності з популяційним і генеалогічним аналізом відкривають широкі перспективи для клінічної і профілактичної медицини.

МПВР – це є комплекс вад розвитку, коли вади стосуються двох органів, що належать до різних систем, їх не більше двох, вони не індукуються одна одною.

Серед них також відмічають хромосомні, моногенні, тератогенні  комплекси і МПВР з неуточненою  етіологією (некласифіковані комплекси). Ця група найскладніша для діагностики і консультування.

Сучасний каталог В. Мак  К’юсика налічує біля 10 000 синдромів. Велике значення має правильне описання фенотипу (тому необхідно направляти на консультацію жінку, якщо вона мала МПВР плоду, ретельно описати фенотип, бажано подробний протокол патологоанатомічного розтину. Правильний синдромальний діагноз дає можливість встановити тип успадкування, запропонувати заходи по його попередженню. В сучасних умовах розповсюджені діагностичні комп'ютерні програми, але вони також вимагають знання генетики, тому що виділяють декілька синдромів, тобто звужують коло пошуку, але все одно потрібний аналіз лікаря.

Принципи діагностики  спадкових захворювань.

1. Аналіз фенотипу з  синдромальним підходом до діагностики.

2. Генеалогічний аналіз, який не потребує великих затрат, однак передбачає добре знання родоводу і вміння лікаря на основі законів успадкування встановити ризик захворювання в сім’ї пробанда (особи, стосовно якої проводиться медико-генетичне консультування). Умови об’єктивного висновку – наявність 3-4 поколінь в генеалогічному дереві, виявлення патології по горизонталі. Суть генеалогічного методу зводиться до з’ясування родинних зв’язків і виявлення ознаки або самого захворювання серед батьків, сібсів (братів і сестер) та інших родичів пробанда. Виділяють два етапи дослідження: складання родоводу і генеалогічний аналіз. Складаючи родовід, проводять індивідуальне опитування і обстеження батьків та інших прямих родичів дитини. Складання родоводу, або генеалогічного дерева, проводять із урахуванням усіх членів по материнській і батьківській лініях пробанда. Рекомендується звертати увагу на всі ймовірні чинники, які можуть мати відношення до захворювання як пробанда, так і будь-якого зі споріднених осіб:

- репродуктивний анамнез  (перелік усіх вагітностей і їх наслідків) з урахуванням ймовірної можливості близької спорідненості шлюбу;

- соматична та інфекційна (в тому числі венерична) патологія,  особливо хвороби, перенесені  під час вагітності;

- контакт з екзогенними  шкідливими чинниками до і  під час вагітності (іонізуюче випромінюівання, токсичні хімічні речовини, тривале лікування сильнодіючими медикаментами);

- національна та вікова  структура сім’ї, в тому числі і батьків у період народження дітей і при появі ознак захворювання;

- соціальні і побутові умови та шкідливі звички.

Розпочинають складати родовід  із центру листка. Символ пробанда поміщають  посередині і помічають стрілкою. Представники одного покоління в межах родоводу розміщуються на одному горизонтальному рівні. Аналізуючи генеалогічні відомості потрібно звертати увагу на ті з них, які асоціюються зі спадковою патологією, в тому числі:1) наявність в сім’ї встановлених спадкових захворювань або дефектів розвитку; 2) споріднені шлюби; 3) хронічні захворювання нез’ясованої етіології; 4) розумова відсталість нез’ясованої етіології (не пов’язана з родовою травмою, нейроінфекцією, епілепсією), особливо в поєднанні з іншими вадами розвитку; 5) відставання у фізичному розвитку, в тому числі гіпотрофія, анорексія і хронічні розлади травного тракту нез’ясованої етіології; 6) хронічні захворювання обох близнюків; 7) природжені аномалії кісток у дітей, особливо у поєднанні з вадами розвитку очей, серцево-судинної системи і опорно-рухового апарату; 8) сімейні випадки бронхолегеневої патології, рання смертність дітей від пневмонії або меконієвого ілеуса; поєднання хронічної легеневої патології з розладами процесу травлення; 9) природжені та сімейні форми глухоти, поєднання глухоти з патологією нирок; 10) аномальна будова статевих органів, особливо у поєднанні з природженою функцією наднирникових залоз і явищами токсикозу і ексикозу; 11) сімейні випадки захворювань сечовидільної системи, зміна кольору, запаху сечі; 12) депігментація шкіри, пігментні плями.

3. Спеціальні генетичні обстеження:

- цитогенетичні – на  основі метафазного аналізу дозволяє  виявити хромосомні хвороби і  аберації. Значно полегшує його  сучасна техніка – оптико-електронний комплекс “Метаскан-2”, програми до якого створили українські вчені. Це такі дослідження, як визначення статевого хроматину, дослідження каріотипу (метафаза мітозу);

а) Дослідження Х-хроматину буккального мазку.

Цей експрес-метод має  суттєве значення при народженні дитини з аномаліями статевої диференціації, коли в мінімально короткий термін треба визначити стать і в ряді випадків (андреногенітальний синдром, особливо сільвтрачаюча форма) почати замісну терапію глюкокортикоїдами по життєвих показах.

В той же час аналіз каріотипу  може бути проведений тільки через 2-3 тижні. Визначення статевого хроматину  основане на феномені гетерохроматизації Х-хромосом. Відомо, що одна із двох Х-хромосом у осіб жіночої статі в інтерфазному ядрі знаходиться в неактивному стані і приймає вигляд глибки хроматину із чіткими контурами, безпосередньо під ядерною мембраною. У жінок відсоток клітин із виявленим Х-хроматином коливається в нормі від 9% до 33% в залежності від фази менструального циклу, у чоловіків в нормі Х-хроматин відсутній.

Методика: після полоскання ротової порожнини стерильним шпателем забирається зіскоб епітеліальних клітин із внутрішньої поверхні щоки, переноситься на предметне скло, фарбується ацеторсеїном, накривається покривним скельцем. Дослідження проводиться за допомогою імверсії в світловому мікроскопі при збільшенні 1:140. Проводиться аналіз в 100 клітинах епітелію, проте до аналізу відбирають тільки клітини з чіткими контурами ядер.

б) Метод дослідження хромосомного набору.

Цей метод дуже широко використовується в практиці медико-гентичного обстеження. Нами цей метод використано при  наявності у пробанда МВВР, аномалій статевої диференціації, у жінок із звичним невиношуванням (2 і більше мимовільних аборти в ранніх термінах вагітності), при безплідних шлюбах, порушеннях оваріально-менструального циклу; для підтвердження клінічно встановлених діагнозів хромосомних захворювань (хвороба Дауна, с-м Патау, с-м “котячого крику”, с-м Шерешевського-Тернера, с-м Клайнфельтера). Цей метод є абсолютно необхідним для визначення повторного ризику народження дітей із хромосомними захворюваннями у даного подружжя. Наприклад: визначення регулярної трисомії у пробанда по 21 хромосомі практично дає сприятливий прогноз для майбутніх дітей, в той же час різноманітні транслокації дають різний відсоток повторного народження дітей з тою чи іншою паталогією. Зокрема, при транслокації 21 хромосоми на гомологічну для неї хромосому 21 пари зумовлює у 100% випадків серед нащадків носія даної перебудови – хворобу Дауна.

Методика: дослідження хромосомного набору проводиться в метафазних пластинках лімфоцитів. Для культивування лімфоцитів у стерильних умовах береться кров у кількості 0.2 мл в флакон із спеціальним середовищем (середовище Ігла з додаванням сироватки великої рогатої хвороби (і куди вводять фітогемаглютинін (ФГА) – специфічний стимулятор мітозу. Даний етап виконується з допомогою ламінарного бокса. Після цього флакон ставився в термостат (темп.-37ºС) на 3 доби – приблизно 70 годин. За цей період мітоз клітин доходить до метафази, коли кожна хромосома може бути ідентифікована. Для пригнічення подальшого процесу поділу в культуру клітин вводять колхіцин (інгібітор поділу). Через 1.5 – 2 години клітини обробляють по методу гіпотонічної обробки (0.56% розчином хлористого калію) і фіксують сумішшю етилового спирту та льодяної оцтової кислоти (3:1). Фарбування проводиться диф.методом (G-методика) по Гімзе з додаванням трипсину. Аналіз хромосом проводиться в світловому мікроскопі при збільшенні в 2000 разів.

- цитологічний аналіз  ядер соматичних клітин людини, дозволяє на основі чотирьох  показників виявити функціональний  стан геному і організму людини  в цілому, вікові і статеві особливості. Визначають ступінь порушення спадкового апарату, зворотність змін та ефективність лікування.

- біохімічні – дозволяють  визначити концентрацію різних речовин (уринолізис, ТШХ, визначення ферментів при хворобах обміну) і опосередковано судити про стан експресії генів, що їх кодують. Особливе значення вони набувають при встановленні гетерозиготності за рецисивним патологічним типом.

Перш за все методи діагностики  спадкових порушень обміну речовин.

Необхідно виділити дві групи  обстежень.

- Скринінг-програма для  виявлення серед хворих з прогредієнтними  психоневрологічними порушеннями  підозрілих на спадкові порушення метаболізму, яка полягає в біохімічному аналізі сечі /уринолізис/ на наявність підвищення кількості тих чи інших метаболітів /якісні тести/ нами використовувались найчастіше наступні тести:

- проба Фелінга /фенілкетонурія, гістидинемія, тирозиноз, лейциноз/,

- проба з 2,4 динітрофенілгідрозином /2,4 ДНФГ/-/фенілкетонурія/,

- проба Бенедикта / на  редуковані речовини при порушеннях  вуглеводного обміну/,

- тест з магнієвим реактивом  / деталізація проби Фелінга /,

- проба на галактозу  і лактозу, 

- проба Сулковича /на  кальцій/ ,

- проба Легаля / на кетонові  тіла / ,

- тест Обермейера / на  індикан /,

- тест на ксантуринову  кислоту, 

- тест на цистин та  гомоцистин.

- У випадках, коли селективний  скринінг при наявності відповідної  клініки виявив ті чи інші відхилення у пробанда, проводились кількісні методи визначення даних порушень: