Извлечение эмбрионов

 

 

                                      Содержание

17.Основные этапы нехирургического  извлечения эмбрионов……………3

18.Причины неудачного  извлечения эмбрионов……………………………6

Список литературы…………………………………………………………..17

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

17.Основные этапы  нехирургического извлечения эмбрионов.

Извлечение эмбрионов нехирургическим способом. Основное преимущество нехирургического способа извлечения эмбрионов заключается в простоте манипуляций. Для этого не требуется специального операционного помещения. Эмбрионы можно извлекать непосредственно в производственных условиях. С селекционной точки зрения, при правильном применении нехирургического способа воспроизводительная способность доноров не нарушается, что позволяет многократно использовать генетически ценных коров-доноров для получения от них большого числа потомков.

При не хирургическом способе извлечения зародыше животных фиксируют в станке. Прямую кишку освобождают от содержимого и проводят тщательное ректальное исследование. Определяют, сколько желтых тел находится в каждом яичнике. Хвост с помощью тесемки фиксируют. Проводят туалет и дезинфекцию наружных половых органов и промежностей. Для прекращения перистальтики прямой кишки эпидурально вводят 10 мл 2%-ного раствора новокаина. Для вымывания зародышей из матки применяют различные инструменты. Используют гибкий одноходовой катетер Фолея с упругим мандреном и надувным баллончиком. Инструмент должен быть стерильным. Сначала катетер вводят во влагалище по верхнему его своду и проводят под ректальным контролем через канал шейки матки в рог матки. Для более полного извлечения зародышей нужно, не травмируя слизистую оболочку, как можно глубже ввести инструмент в рог матки после того как катетер достигнет в роге матки необходимого положения, мандрен удаляют и в баллончик катетера накачивают 10–15 мл воздуха. При этом катетер фиксируется в роге матки и промывная жидкость не вытекает мимо катетера.

Закрепив катетер, промывают полость рога матки с помощью шприца Люэра вместимостью 50–60 мл. В рог матки в зависимости от его величины вводят порциями от 40–60 мл промывной жидкости, затрачивая на промывание каждого рога не более 500 мл. Наполнение матки промывной средой и степень ее оттока контролируют ректально.

Для более полного извлечения зародышей верхушку рога матки приподнимают и выпрямляют. Некоторые авторы рекомендуют яйцепровод вблизи верхушки рога матки осторожно зажать большим и указательным пальцами. При этом предотвращается поступление в брюшную полость жидкости, содержащей зародыши. Но практика показывает, что поступление в брюшную полость жидкости из рога матки отмечается только при наличии большого давления в матке, поэтому яйцепровод можно не зажимать. Перед извлечением катетера следует удалить воздух из баллончика. Таким же образом промывают и второй рог.

В качестве среды для промывания используют фосфатно-буферный солевой раствор (ФБС) Дюльбекко.

Раствор готовят на тридистиллированной воде. Первые 4 вещества растворяют 800 мл, а 5-е и 6-е каждый отдельно в 100 мл. в итоге получают три раствора которые автоклавируют, а затем смешивают. В таком виде их можно хранить при 4 градусах до 2 недели. Непосредственно перед употреблением в ФБС вводят следующие компоненты (в расчете на один литр): альбумин бычьей сыворотки – 4г; глюкоза – 1г; натрий-пироват – 0,036г; пенициллин – 100 тыс. ЕД.

Собранную в цилиндр промывную жидкость отстаивают 20–35 мин. при температуре 20–37 градусов, чтобы зародыши опустились на дно, после чего верхний слой удаляют с помощью сифона. Нижний слой жидкости порционно по 20–30 мл для обнаружения зародышей исследуют в больших часовых стеклах или чашках Петри под бинокулярной лупой при 10–50-кратном увеличении. Найденных зародышей при помощи пастеровской пипетки переносят в среду для кратковременного хранения (среда Дюльбекко с добавлением 20% фетальной сыворотки теленка). После оценки зародышей их культивируют при 37 градусах до момента пересадки или оставляют для хранения.

Во многих странах разработаны различные устройства для нехирургического извлечения эмбрионов. В нашей стране успешно освоены нехирургические методы извлечения, позволяющие получать 60% от числа овулировавших яйцеклеток. Нужно иметь в виду, что в среднем из вымытых яйцеклеток до 25% оказываются неоплодотворенными или дезинтегрированными. Причины выхода биологически неполноценных зигот до сих пор окончательно не выяснены.        

Манипуляции с ранними эмбрионами, находящимися на предимплантационных стадиях развития, т.е. от момента их получения до введения в рога матки реципиента, занимают от 1 до 5 часов. В этот период нужно создать оптимальные условия, обеспечивающие сохранение их биологических качеств. Кратковременное хранение эмбрионов дает также возможность транспортировать их в другие хозяйства.

По морфологическим признакам и эмбриональной стадии развития, эмбрионы можно классифицировать  на пригодные и непригодные к трансплантации. При морфологической оценке эмбрионов основное внимание обращают на форму зиготы, состояние её зоны пеллюцида, число бластомеров, равномерность дробления, выраженность эмбриобласта и трофобласта.

Кроме морфологической, дается оценка эмбрионов по адсорбционным свойствам оболочек и цитоплазмы бластомеров к различным красителям. Для улучшения морфологической оценки используют флюоресцентную окраску, позволяющую отличить живые эмбрионы от погибших. В частности, этот метод наиболее пригоден для оценки жизнеспособности эмбрионов крупного рогатого скота после их культивирования и замораживания. С помощью флюоресцентных красящих веществ FDA и DAP1 через 3-10-минутный период возможно быстрое и достаточно надежное определение способности эмбрионов к развитию в ранних стадиях. Живые эмбрионы и даже живые бластомеры ярко флюоресцируют после инкубации в FDA, но не флюоресцируют после инкубации в DAP1. У погибших эмбрионов или бластомеров реакции обратные. Эти методы позволяют более точно определять жизнеспособность эмбрионов под микроскопом.

Ряд авторов предлагает использовать синьку Эванса. В живых эмбрионах при температуре 37 градусов ею окрашивается только зона пеллюцида, которую затем обесцвечивают в растворе Рингера. В мертвых же эмбрионах краска прочно фиксируется на бластомерах.

Как считает М. И. Прокофьев , могут быть гистохимические методы оценки жизнеспособности эмбрионов, основанные на специфических реакциях структурных элементов и веществ клеток к витальным и флюоресцентным красителям. Такие реакции протекают очень интенсивно и быстро, что позволяет ускорить процесс оценки эмбрионов.

Однако следует учитывать, что флюоресцентная окраска лишь дополняет и улучшает основной метод оценки эмбрионов - морфологический. Наиболее важными морфологическими признаками при оценке жизнеспособности эмбрионов служат объем, окраска, расположение клеток, величина перивиталлинового пространства и вид неповрежденной зоны пеллюцида. Идеальный эмбрион должен быть компактным, сферической формы, с однородной окраской, с клетками одинаковой величины, с гладкой, плоской и равномерно сформированной зоной пеллюцида, без включений в перивителлиновом пространстве.

Важнейшим критерием для оценки качества эмбрионов является интенсивность развития стадий. Эмбрионы с замедленным развитием не используются для пересадки, замораживания и других манипуляций.

При оценке качества эмбриона в нашей стране принята 5-балльная шкала с учетом следующих показателей: соответствия стадии развития эмбриона его возрасту; правильности формы прозрачной оболочки и ее целостности; равномерности дробления бластомеров, состояния цитоплазмы; прозрачности перивителлинового пространства.

Наиболее пригодными для трансплантации являются эмбрионы, извлеченные из матки коровы-донора на 7-8 сутки после первого осеменения. Как показывают результаты исследований и практика, в это время нормально развитые эмбрионы, пригодные для трансплантации реципиентам, находятся в стадии поздней морулы или бластоцисты. Эти эмбрионы используют для пересадки гормонально подготовленным коровам-реципиентам.

Выбраковке подлежат дегенерированные неоплодотворенные яйцеклетки (ооциты), которые можно обнаружить при извлечении эмбрионов. Морфологически неинтактные, непригодные для трансплантации эмбрионы имеют дефектную морулу, или бластоцисту, признаками которых являются дефекты прозрачной оболочки, распад бластомеров, разная величина бластомеров, нарушение межклеточной связи.

В стадии поздней бластоцисты непригодные для трансплантации эмбрионы характеризуются деформацией и ослаблением бластомеров, разрывом межклеточных связей и целостности зоны пеллюцида. 

 

18.Причины неудачного  извлечения эмбрионов.

В настоящее время во многих странах ведутся интенсивные работы по разработке оптимальных способов получения и пересадке эмбрионов крупного рогатого скота. Основной задачей этих исследований является повышение приживляемости эмбрионов, которая зависит от многих факторов. Одним из главных условий успешного применения метода трансплантации в животноводстве является асептичность всех проводимых операций. Необходимо точно соблюдать санитарные правила при манипулировании с эмбрионами вне организма, чтобы не допустить их инфицирования и переноса инфекции реципиентам при эмбриотрансплантации..Известно, что матка коровы легко инфицируется в лютеальной фазе полового цикла и устойчива к заражению в эстральный период. Поскольку нехирургическая пересадка эмбрионов у крупного рогатого скота осуществляется в период диэструса, когда резистентность матки резко понижена к микробному фактору, то даже при отрицательной бактериологической оценке инструментов вирусный контакт не исключается.

Субклиническая инфекция у реципиентов после нехирургической пересадки приводит к частым абортам.

Манипуляция вымывания эмбрионов и подготовка их к пересадке, как было сказано выше, требует тщательных асептических условий. Но даже. при соблюдении их, возможность попадания различной микрофлоры в матку не исключена .Одной из причин низкой результативности нехирургических пересадок, очевидно, является чувствительность матки к инфекции в лютеальную фазу .

Для предотвращения возможного заноса микрофлоры в полость матки применялись различные устройства. И. Перрин и соавт. использовали приспособление, позволяющее в условиях ферм производить цервикальную трансплантацию не соприкасаясь со средой слизистой влагалища. При этом приживляемость эмбрионов повысилась на 21%) для зачехления инструмента при пересадке эмбрионов использовал специальную защитную оболочку из парафинированной стерильной бумаги.

В качестве дополнительной предосторожности от возможной влагалищной инфекции у реципиента сотрудники Кембриджского института покрывали наконечник пистолета Кассу пластиковым чехлом.Большинство практиков в странах СНГ катетер для пересадки эмбрионов покрывают защитной полиэтиленовой оболочкой, которая предназначена для предупреждения контаминации прибора микрофлорой при введении его во влагалище до наружного отверстия шейки матки .

Ф.И. Осташко и соавт. (1986) для асептического получения эмбрионов сельскохозяйственных животных, их поиска, оценки и хранения создали специальное устройство.

Сыворотка и другие компоненты среды, используемые для сбора, отмывания и культивирования эмбрионов могут быть специальными источниками инфекции, поэтому качество их приготовления должно систематически контролироваться. Кроме того, после извлечения эмбрионов из матки инфицированных и неинфицированных коров-доноров в промывных средах многие исследователи обнаружили бактерии и вирусы, что послужило основанием для санирования промывных буферных сред антимикробными препаратами. Отметили, что после проведения нескольких вымываний у коров-доноров развивается гнойный эндометрит.

Другим важным моментом при трансплантации является подготовка эмбрионов к пересадке.

Ряд зарубежных авторов считают, что уязвимость эмбриона патогенами маловероятна из-за основной резистентности, которая обеспечивается зоной пеллюцида, и факторов вторичной резистентности таких, как ранний возраст, малые размеры и ограниченная подвижность, что уменьшает потенциальную возможность воздействия патогенов на эмбрион. То, что многие бактериальные и вирусные патогены, как было доказано, слишком велики, чтобы проникнуть сквозь прозрачную оболочку и что некоторые не выживают в питательной среде эмбриона, объясняет дальнейшее уменьшение возможности передачи инфицирующего агента во время пересадки эмбриона.

Зона пеллюцида (толщина 5-15 мкм) является эффективным барьером для микроорганизмов. Исследования показали, что это касается большинства микробов, вызывающих заболевания у крупного рогатого скота. При тщательном промывании эмбриона, с интактной прозрачной оболочкой, исчезали все признаки патогенных агентов .Микробиологические исследования in vitro показали, что отмывка эмбрионов в нескольких стерильных средах снижает концентрацию вирусов и бактерий в среде до неопасного субинфекционного уровня уже после третьего разбавления. Технически отмывка эмбрионов выполняется путем последовательного переноса микропипеткой эмбриона с минимальным количеством жидкости (около 0.01 мл) из одной стерильной чашки с 1 мл среды в другую. Разбавление концентрации исходного раствора среды при этом таково, что уже в третьей чашке она превышает в 1000 раз, а в девятой чашке даже тонкий анализ не выявляет следов инфекции. Дополнительную гарантию полного блокирования случайной инфекции дает добавление антибиотика в стерильную среду. Эффективность такого способа подтверждена в опытах с использованием вирусов блутанга, акабаны, инфекционной диареи .В настоящее время известно, что только вирусы инфекционного ринотрахеита (E. Singh et al., 1982) и везикулярного стоматита (L. Laurman et al., 1985) взаимодействуют с оболочкой эмбриона и остаются на ней даже после многократных отмываний. Результаты исследований А.И. Сергиенко и соавт. (1988) показывают, что даже десятикратная промывка не обеспечивает освобождение эмбрионов от вируса ИРТ. Только обработка эмбрионов ферментами (трипсином) или антисывороткой эффективно удаляет вирусы с оболочки (E. Singh et al., 1983). В результате обработки эмбрионов ферментом растворяется верхний слой оболочки и полностью удаляются (инактивируются) налипшие на ней вирусные частицы.

С другой стороны, культивирование зародышей in vitro осуществляли при высокой концентрации микроорганизмов и вирусов в среде, которая в естественных условиях in vivo менее вероятна. После использования трипсина вирусы ринотрахеита и везикулярного стоматита на оболочке не обнаруживали. Повреждение оболочки или ее отсутствие приводило к инфицированию зародыша и его гибели при блутанге, ящуре, ринотрахеите.