Контроль виробництва

Поліетиленові пакети з продуктом  запаюють на запаюючій машині. Запаяний пакет з продуктом вкладають в другий пакет, який також запаюють.

Між внутрішнім і зовнішнім  пакетом укладають етикетку, на якій указують:

   Транспортну маркіровку  проводять відповідно до ГОСТ 13563-69.  Від кожної серії готового продукту препарату захисту рослин Боверин у  сухому вигляді відбирають середню пробу для аналізу  згідно ТУ У 24-2-00495929-002:2007. Готовий продукт зберігають в карантинному складі при температурі від 15 ^°С до 20°С^.        Партію препарату маркірують етикеткою, на якій указують:

• найменування препарату;
• номер серії;
• дата виробництва;
• кількість;
• карантин на випробуванні.

    Після отримання  результатів випробувань  готовий  продукт  по протоколу здають  на склад  готового продукту  разом з сертифікатом якості.   Після проведення технологічного процесу устаткування і приміщення готують до роботи і ідентифікують етикеткою з вказівкою:

• Найменування устаткування (приміщення)
• «чисто»
• дати підготовки
• підписи особи, що підготувала устаткування (приміщення)
• підписи особи, відповідальної за підготовку устаткування (приміщення).                1.7. Маркування

       На кожну  одиницю споживчої тари наклеюють  етикетку, яка містить : Україна,  назву підприємства-виробника, його  товарний знак, назву продукту, номер    партії, маса нетто, кількість  життєздатних клітин Beauveria bassiana, дату виготовлення, гарантійний строк зберігання і умови зберігання, з нанесенням маніпуляційного знаку ″ Берегти від нагріву″ ( для рідкої форми ), ″ Берегти від вологи ″ ( для сухої форми ), позначення технічних умов на препарат захисту рослин Боверин.          До кожної упаковки препарату Боверин, упаковану в споживчу або транспортну тару, має бути доданий листок-вкладиш.

          Розділ 2. Характеристика грибу Beauveria bassiana     З метою отримання препарату для захисту рослин Боверин   використовують ентамопатогенний гриб Beauveria bassian.     Штам мікроскопічного гриба Beauveria bassiana  ТС-92 отриманий шляхом селекціонування штаму Beauveria bassiana 124 / 1 з наступним відбором клонів за продуктивністю, біологічної ефективності на тест-комах і терморезистентності. Штам депонований в Центральній колекції мікроорганізмів державного концерну "Біопрепарат" під N ЦКМ F-54 Ц. Для отримання ентомопатогенних препаратів штам вирощують на рідкому поживному середовищі, що містить 1% технічної глюкози, 3% гліцерину і 7% гідролізату білково-вітамінного концентрату при 25 ° С при аерації протягом 57 год, отриману культуральну рідину концентрують у 10 разів за обсягом, вводять стабілізатор і змочувач. Біологічна ефективність препарату проти трипса огірка при робочій концентрації 1% становить 90%.

2.1. Систематика.

Ентомопатогенний гриб Beauveria bassiana - це недосконалий гриб (Fungi imperfacti). Рід Beauveria bassiana, відноситься до класу Deuteromycites. Відрізняється від інших родів добре розвинутим міцелієм,  наявністю конідій, які тримаються поодинці, не розташовуються дрібними ланцюжками, і мають фертильну частина конідіофори у формі зигзага і витягнуту догори. Вид Beauveria bassiana має сферичні, не еліпсоїдальних конідії розміром 2-3 - 2-2,5 мкм, які утворюють щільні пучки .         Згідно з класифікацією грибів, розробленою у 70 – х на початку 80-х років ХХ ст.(Moreau 1978р.)        Надцарство   Eucaryota        Царство            Fungi         Відділ                 Eumycota         Клас                    Deuteromycetes       Родина               Clavicipitaceae        Рід                      Beauveria         Вид                     Beauveria bassiana 

                                                                                                    Таблиця 2.1.1 

Система грибів Кавалір-Сміта (1988 р.)

Отже, за однією з сучасних систематик Кавалір – Сміта (1998) Beauveria    bassiana відносять до відділу Аscomycota і класу Plectomycetes. Характеризуються добре розвинутим міцелієм, міцелій септований [8].   2.2. Морфолого – культуральні ознаки Beauveria bassiana.  Beauveria bassiana — ентомопатогенний гриб сімейства Clavicipitaceae, відомий ще як збудник білої мускардини. Beauveria bassiana має багато штамів проявляючих значні відмінності в вірулентності, патогенності і специфічності. Штам гриба Beauveria bassiana TC-92 характеризується наступними культурально-морфологічними ознаками.        При вирощуванні штаму на твердому середовищі Чапека при 26-27ºС протягом 6 діб колонії білуватого кольору з точкою в центрі, з рівними краями. Повітряний міцелій розгалужений (рис. 2.2.1.), септований, гіфи міцелію в діаметрі 3,0 - 5,0 мкм. Конідієносці бутилевидні (рис. 2.2.2.), формуються поодиноко, попарно. Розмір конідій 2,8 - 3,5 мкм одноклітинні, одноядерні. На середовищі Сабуро, при тих же умовах, вирощування колонії з рівними краями, білі з кремовим відтінком зверху і знизу, що вростають в агар, на сусло-агарі формує зморшкуваті колонії кремового кольору знизу і білі зверху, плоскі з піднесеним центром [2].

Рис.2.2.1. Гриб Beauveria bassiana в скануючому мікроскопі (конідії та міцелій)

Рис. 2.2.2. Гриб Beauveria bassiana в скануючому мікроскопі (конідії)

2.3. Фізіолого – біохімічні  ознаки Beauveria bassiana.

Ентомопатогенний гриб Beauveria bassiana росте при температурі 18 - 32ºС, оптимальною є температура 25-28ºС. Оптимальне рН середовища становить 4,5 - 5,6. Гриб Beauveria bassiana – це аероб.     Гриб Beauveria bassiana за типом живлення є хемоорганогетеротрофом. Ставлення до джерел вуглецю: засвоює крохмаль, сахарозу, глюкозу, лактозу, гліцерин. Ставлення до джерел азоту, як донора електронів: утилізує пептон, казеїн, рибо-кісткове борошно, м'ясний бульйон, дріжджі та їх гідролізати. Ставлення до джерела енергії: використовують хімічні сполуки.  При глибинному культивуванні штаму ТС-92 на різних складах середовищ відбувається зміна рН культуральної рідини залежно від складу середовища.           Штам гриба Beauveria bassiana TC-92 отриманий шляхом селекції штаму Beauveria bassiana 124 / 1 на рідких і твердих поживних  що містять гідролізат білково-вітамінного концентрату (БВК) і гліцерин з подальшим відбором чистих культур за продуктивністю, біологічної активності на тест-комах і терморезістності.          Досліджено терморезистентність штамів Beauveria bassiana TC-92 і вихідного штаму Beauveria bassiana 124 / 1 при температурі 80ºС протягом 1-2 хв. Отримали такі такі результати, що запропонований штам є стійкішим  на 20%. Біологічна ефективність штаму ТС-92 на личинках оранжерейної білокрилки і павутинного кліща, при обприскуванні рослин суспензією з титром 107 спор / мл, складає 65 і 55% на 5-у добу, а у відомого відповідно 55 і 40% .             Приклад використання штаму ТС-92 для отримання ентомопатогенних препарату.             У рідке сприятливе середовище, що містить 1% крохмалю, 3% гліцерину і 7% гідролізату БВК, вносять 5% посівної спорової культури штаму ТС-92 і культивують при температурі 25ºС і аерації в ферментері об'ємом 50 л протягом 57 год. Отриману культуральну рідину концентрують в 10 разів. У концентрат вводять змочувач і стабілізатор суспензії і  отримують препарат в рідкому вигляді. Біологічна ефективність отриманого препарату проти трипса огірка, при робочій концентрації 1%, становить 90%.      Таким чином, запропонований штам перевершує батьківський штам по продуктивності і біологічної ефективності [11].     

2.4. Розмноження грибу.

Гриб Beauveria bassiana розмножується шляхом  проникнення спори в порожнину тіла через шкірні покриви (кутикулу). Потрапивши в тіло, спора проростає в гіф, потім розростається міцелій, від якого відходять конідії. Виявившись у тілі, конідії циркулюють у гемолімфі. Уже на цій стадії можливе ураження комахи внаслідок виділення деякими штамами значної кількості токсинів. Під час відсутності токсину міцелій поступово заповнює все тіло комахи, насамперед вражається м'язова тканина. Ріст гриба триває доти, поки всі тканини не будуть зруйновані. Можуть утворюватися конідієносці, що проривають кутикулу й обплітають мертву личинку.  Уражена комаха покривається білим ватяним нальотом.

2.5. Схема біотрансформації  ростового субстрату в біомасу  грибу Beauveria bassiana          Процес біосинтезу Боверину можна поділити на такі етапи: 1) синтез амінокислот – попередників білків; 2) синтез пуринів і піримідинів – попередників нуклеїнових кислот; 3) синтез жирних кислот – попередників ліпідів; 4) синтез нуклеозиддифосфатпохідних вуглеводів.     На рис 2.5.1. показано схему синтезу біомаси продуценту препарату захисту рослин Боверину з крохмалю[12].        Ростовим субстратом, для одержання біомаси грибу  Beauveria bassiana, є крохмаль,  який за допомогою гідролізу перетворюється на глюкозу, а далі перетворення йде за гліколітичним шляхом. Ключовими ферментами катаболізму даного ростового субстрату є 1-фосфофруктокіназа та 6-фосфофруктокіназа.     

2.5.1. Синтез амінокислот.

Даний мікроорганізм Beauveria bassiana має здатність синтезувати всі 20 амінокислот, з яких складаються білки. Вуглецеві скелети амінокислот будуються з проміжних продуктів обміну, аміногрупи вводяться прямим амінування або транс- амінуванням. Переведення неорганічного азоту в органічні сполуки завжди відбувається через аміак. Нітрати, нітрити, молекулярний азот (джерела азоту в поживних середовищах) попередньо відновлюються до аміаку (асиміляційна нітратредукція) і тільки після цього включаються до складу органічних сполук.      Лише небагато амінокислот утворюються в результаті прямого амінування вільними іонами амонію. У первинній асиміляції аміаку беруть участь L-глутаматдегідрогеназа та L-апаніндегідрогеназа, які здійснюють відновлювальне амінування 2-оксокислот (пірувату та 2-оксоглутарату). АТФ у цьому процесі участі не бере. Утворення глутаміну з глутамату каталізується глутамінсинтетазою і потребує витрат АТФ. За допомогою глутаматсинтази аміногрупа глутаміну може бути перенесена на 2-оксоглутарат з утворенням глутамату.            Решта амінокислот отримує свою аміногрупу від первинних амінокислот в результаті трансамінування. З вільних амінокислот у цитоплазмі кількісно переважає глутамінова кислота.         Всі необхідні для синтезу білків 20 амінокислот утворюються з певних метаболічних попередників.          Як видно з наведених даних, субстратами для синтезу амінокислот є кілька сполук - піруват, оксалоацетат, 2-оксоглутарат, 3-фосфогліцерат, фосфоенолпіруват, еритрозо-4-фосфат і 5-фосфорибозил-пірофосфат. Оксалоацетат являє собою відправну точку для синтезу п`яти амінокислот, 2-оксоглутарат   є   попередником   синтезу   п`яти,   а   піруват   -   трьох амінокислот.           Аланін та аспартат синтезуються з пірувату та оксалоацетату трансамінуванням з використанням глутамату як донора аміногрупи. Аспарагін утворюється в реакції, аналогічній реакції, що каталізується глутамінсинтетазою. Відновлення аспартату дає напівальдегід аспарагінової кислоти - попередник лізину, треоніну та метіоніну. Серин, гліцин і цистеїн синтезуються з 3-фосфогліцерату, а пролін та аргінін - з глутамату.   2.5.2. Синтез жирних кислот.

Більшість жирних кислот, які входять  до складу бактеріальних ліпідів, містять 16 або 18 атомів вуглецю. Ці кислоти є  або насиченими, або мають один чи більше подвійних зв'язків. Попередником жирних кислот є ацетил-КоА. Проте  подовження ланцюга у даному разі не відбувається за рахунок конденсації  двох молекул ацетил-КоА з наступною  подальшою конденсацією утвореної  С₄-сполуки з ацетил-КоА. У біосинтезі жирних кислот є дві принципові відмінності:          1.   КоА-похідні не є субстратами ферментів, що беруть участь у синтезі жирних кислот. Замість них використовується ацилпереносний білок (АЛБ), який містить як простетичну групу 4^_фосфопантетеїн, тобто є схожим на кофермент А. Перша реакція у синтезі жирних кислот - це утворення ацетил-АПБ:             Ацетил-КоА + АПБ          Ацетил-АПБ + КоА.      2.  Ацетил-АПБ функціонує у синтезі жирних кислот як затравка, а С₂-фрагменти приєднуються до цієї затравки у формі малоніл-КоА. Малоніл-КоА синтезується з ацетил-КоА у два етапи.       Для подовження ацил-АПБ на два атоми вуглецю необхідно чотири ферменти. Спочатку ацетил-АПБ реагує з малоніл-АПБ з утворенням ацетоацетил-АПБ, який потім відновлюється до β-гідроксибутирил-АПБ. Відщеплення води дає кротоніл-АПБ, а наступне відновлення приводить до утворення бутирил-АПБ:          1) Ацетил-АПБ + Малоніл-АПБ       Ацетоацетил-АПБ +С0₂ + АПБ     (3-кетоацил-АПБ-синтетаза);     2) Ацетоацетил-АПБ + НАДФН     β -гідроксибутирил-АПБ + НАДФ     (3-кетоацил-АПБ-редуктаза);      3) β -гідроксибутирил-АПБ           Кротоніл-АПБ + Н₂0       (β-гідроксиацил-АПБ-дегідратаза);     4) Кротоніл-АПБ + НАДФН        Бутирил-АПБ + НАДФ        (еноїл-АПБ-редуктаза).     Точкою розгалуження синтезу насичених і ненасичених жирних кислот є β-гідроксидеканоїл-АПБ.        Основними субстратами для утворення фосфатидних кислот є 3-фосфогліцерин та ацил-АПБ. 3-Фосфогліцерин утворюється з діоксиацетонфосфату - проміжного продукту гліколізу. Фосфатидні кислоти утворюються в результаті перенесення ацильного залишку від ацил-АПБ на 3-фосфогліцерин. Більша частина фосфатидних кислот (через стадію утворення складних ефірів із спиртами) використовується для синтезу фосфоліпідів.  Попередниками піримідинових нуклеотидів є карбамоїлфосфат та аспартат. Конденсація цих сполук дає карбамоїласпартат, який піддається циклізації і перетворюється на 4,5-дигідрооротат. Дегідрування цієї сполуки приводить до утворення оротату - першого проміжного продукту, який містить піримідинове кільце. Рибозо-5-фосфат, утворений у пентозофосфатному циклі, активується перетворенням у 5-фосфорибозил-1-пірофосфат. Реакція 5-фосфорибозил-1-пірофосфату з оротатом дає оротидинмонофосфат, який далі декарбоксилюється в уридинмонофосфат .       У результаті метаболічного шляху, який починається з 5-фосфорибозил-1-пірофосфату утворюється імідазольний нуклеотид. Три атоми піримідинового кільця, необхідні для утворення пуринового кільця з імідазольного нуклеотиду, надходять із бікарбонату, аспартату та форміл-тетрагідрофолієвої кислоти. Замикання кільця дає інозинмонофосфат (пуриновий нуклеотид, ІМФ). Декілька додаткових реакцій приводять від ІМФдо АМФ або до ГМФ, і нарешті утворюються АТФ та ГТФ. Відновлення рибонуклеотидів до дезоксирибонуклеотидів відбувається на рівні дифосфатів.   Відновлювальним агентом у цій реакції є флавопротеїдтіоредоксин, його відновлена форма регенерується за рахунок НАДФН.