Контроль виробництва

2.5.3. Утворення  та синтез вуглеводів.

Вуглеводи у даному біосинтезі утворюються  з клітинної стінки граба Beauveria bassiana. Якщо субстратом служить крохмаль, який гідролізує з утворенням  глюкози, то продуктами катаболізму глюкози є глюкозо-6-фосфат, фруктозо-6-фосфат, фруктозо-1,6-дифосфат, у пентозофосфатному циклі утворюються рибулозо-5-фосфат, ксилулозо-5-фосфат, рибозо-5 -фосфат. У разі невуглеводних субстратів такі вуглеводи, як глюкозо-6-фосфат, фруктозо-6-фосфат, фруктозо-1,6-дифосфат, синтезуються в реакціях глюконеогенезу. Взаємоперетворення моносахаридів відбувається через нуклеозиддифосфатсахариди (наприклад, через УДФ-похідні).    Попередником    ліпополісахариду    клітинної    стінки    є гексозаміни, що утворюються з фруктозо-6-фосфату. Фруктозо-6-фосфат перетворюється на глюкозамін-6-фосфат за рахунок глутаміну як донора аміногрупи:   Фруктозо-6-фосфат + Глутамін       Глюкозамін-6-фосфат + Глутамат.  Із глюкозамін-6-фосфату утворюються інші гексозаміни. УДФ-N-ацетилмурамова кислота та УДФ-ацетилглюкозамін-попередники пептидоглікану - також синтезуються з глюкозамін-6-фосфату (див. схему). Спочатку фосфатна група переноситься з положення 6 у положення 1 з утворенням глюкозамін-1-фосфату. Наступна реакція з ацетил-КоА дає N-ацетилглюкозамін-І-фосфат, який зв'язується з УДФ. На останньому етапі УДФ-N-ацетилгаюкозамін реагує з фосфоенолпіруватом, утворюючи УДФ-N -ацетилмурамову кислоту.         Будівельним блоком пептидоглікану є УДФ-N-ацетилмураміл пентапептид. Пентапептид синтезується з УДФ-N -ацетилмурамової кислоти в результаті послідовних реакцій з L-аланіном + АТФ, D-глутаматом + АТФ, мезо-діамінопімелатом + АТФ та D-аланіл-D-аланіном + АТФ [9].  

 

 

 

Розділ 3. Обгрунтування  опису технологічної схеми виробництва

Вибір технологічної схеми  направлений на вдосконалення технологічного процесу і підвищення якості продукції.      Основною метою обґрунтування є вибір оптимального технологічного, апаратурного рішення на підставі аналізу існуючої інформації.

3.1 Обґрунтування  вибору технології виробництва  препарату   Обробка сільськогосподарських рослин за допомогою хімічних препаратів має ряд недоліків. По-перше, абсолютна більшість пестицидів є сильними біологічними активними речовинами і негативно впливають на рослини. Це може виразитись в погіршенні росту, розвитку і загального стану рослини. По-друге, дуже часте використання пестицидів може знищити всю мікрофлору, в першу корисну, так як вона є дуже чутливою до цих препаратів. Цим порушуються нормальні мікробіологічні процеси в грунті. Приклад – виникнення  м’якої гнилі в картоплі, внаслідок багаторазових опрацювань пестицидами проти колорадського жука. По-третє, невміле використання пестицидів може сприяти появі нових стійких форм організмів-шкідників. В ситуації, що склалась в сільському господарстві одним з виходів є заміна пестицидів на мікроорганізми (бактерії, актиноміцети, гриби), живі організми (хижаки і паразити шкідників і збуджувачів хвороб), або продукти їхньої життєдіяльності [1].           В даний час розроблені технології виробництва і застосування біопрепаратів на основі ентамопатогенних грибів. Це сприяє підвищенню їх стійкості до різних стресів і фітопатогенів, зростанню врожайності та якості продукції рослинництва при збереженні і родючості грунтів.    Виходячи з попередніх даних, можна сказати, що створення біопрепарату для захисту рослин біотехнологічним способом є набагато перспективнішим варіантом, ніж виготовлення препарату хімічним способом.   Перед тим як розпочати процес виготовлення біопрепарату Боверин  потрібно провести санітарну обробку обладнання і приміщень, підготовки одягу персоналу та ряд інших вимог, для забезпечення необхідного рівня асептики на стадії біосинтезу.

3.2. Аналітичний   огляд способів і методів реалізації  мети виробництва препарату Боверин

Обґрунтування вибору способу стерилізації поживного  середовища

Поживне середовище можна  стерилізувати різними способами, наприклад, при витримці певної температури  за деякий час, подачею гарячого стисненого повітря в сорочку апарату, опроміненням, хімічними способами, але ці способи  не завжди ефективні, тому що хімічні  компоненти можуть порушити склад  середовища чи іншими способами. Стерилізація проводиться в залежності від  компонентів поживного середовища.       Основним джерелом вуглецю при біосинтезі є крохмаль. Для кращого збереження вихідних якостей поживного середовища запропоновано проводити стерилізацію крохмалю окремо від інших компонентів поживного середовища. Найбільш ефективним способом стерилізації є витримка при високій температурі в стерилізаторі.          До складу середовища для вирощування грибу Beauveria bassiana входять такі компоненти як, крохмаль, кукурудзяний екстракт, суспензія дріжджів та солі. Враховуючи всі особливості цих елементів та на основі вище сказаного, стерилізацію проводять в наступному режимі: 

• Крохмаль: температура стерилізації – 112-115ºС, тиск – 0,05 мПа;
• Кукурудзяний екстракт: температура стерилізації - 120±2ºС,            тиск – 0,05мПа;
• Суспензія дріжджів: температура стерилізації - 100ºС,                      тиск – 0,15-2 мПа;
• Солі: температура стерилізації – 112-115ºС, тиск 0,05 мПа.

Після стерилізації поживне  середовище охолоджують, при працюючій мішалці, до температури 26 ºС подачею стерильного стисненого повітря в апарат, а потім оборотної води в апарат .        Після охолодження поживного середовища, готують інокулят і посівний матеріал. Особливістю підготовка інокуляту і посівного матеріалу є те, що посівну культуру вирощують у колбах на качалках до експоненційної фази росту.              Після вирощування посівної культури в колбах на качалках суспензію подают в інокулятор де відбувається виробничий біосинтез.

 

3.3. Обгрунтування  вибору продуцента      Боверин – грибний інсектицидний препарат, який отримують шляхом глибинного культивування гриба Beauveria bassiana, штам ТС-92.                  Beauveria bassiana - энтомопатогенний гриб сімейства Clavicipitaceae, широко відомий ще як збудник білої мускардини. Beauveria bassiana має багато штамів значні розходження, що проявляють, у вірулентності, патогенності й специфічності [6].           Відомі штами грибів виду Beauveria bassiana для виробництва ентомопатогенних препаратів. Найпоширенішим штамом штамом є Beauveria bassiana 124/1. Основним недоліком відомого штаму є його невисока ефективність і низька терморезистентність. Для виключення цих недоліків було одержано штам гриба Beauveria bassiana TC-92, отриманий шляхом селекції штаму Beauveria bassiana 124 / 1 на рідких і твердих поживних середовищах, що містять гідролізат білково-вітамінного концентрату (БВК) і гліцерин з подальшим відбором чистих культур за продуктивністю, біологічної активності на тест-комах. Штам депонований в Центральній колекції мікроорганізмів державного концерну "Біопрепарат" (ЦКМК "Б") під N ЦКМ F-54Ц.   Досліджено терморезистентність штамів Beauveria bassiana TC-92 і вихідного штаму Beauveria bassiana 124 / 1 при температурі 80ºС протягом 1-2 хв. Отримали такі такі результати, що запропонований штам Beauveria bassiana TC-92 є стійкішим на 20%. Біологічна ефективність штаму ТС-92 на личинках оранжерейної білокрилки і павутинного кліща, при обприскуванні рослин суспензією з титром 10⁷ спор / мл, складає 65 і 55% на 5-у добу, а у штаму Beauveria bassiana 124 / 1  відповідно 40% .      Отже, перевага штаму Beauveria bassiana TC-92 для виробництва препарату захисту рослин Боверин полягає в тому, що даний штам має вищу термирезистентність, є стійкішим на 20%,  біологічна ефективність вища на 15-25%.              3.4. Обгрунтування вибору складу поживного середовища для вирощування грибу  Beauveria bassiana.       Виходячи з того, які елементи потрібні  і в яких співвідношеннях, для вирощування продуценту Beauveria bassiana може бути використане поживне середовище такого складу:         Дріжджі кормові – 2%, крохмаль – 2%, хлорид натрію – 0,2%, хлорид марганцю – 0,01%, хлорид кальцію – 0,05%, кукурудзяний екстракт  – 1%,  К2НРО4 – 0,03%, MgSO₄x7H₂O  - 0,04%, FeSO₄x7H₂O – 0,01%. Крохмаль замінюють на глюкозу ( при необхідності ) [2].       Джерело вуглецю.         Крохмаль – рослинний полісахарид з дуже складною будовою, який є джерелом вуглецю для продуценту Beauveria bassiana. Це двокомпонентне з'єднання, що складається з 13 – 30% амілази і 70 – 85% амілопектину. Обидва компоненти неоднорідні, їх молекулярна маса коливається в широких межах і залежить від природи крохмалю. Амілаза практично не володіє відновлювальною властивістю, так як в кожній молекулі амілази існує тільки одна вільна альдегідна група.           Молекула амілази представляє собою розтягнуту спіраль, яка в розчині стискається за рахунок збільшення витка, в якому вже приймають участь 6 залишків глюкози. При входженні молекул йоду в спіраль амілази виникає характерне синє забарвлення.       Амілопектин має більшу молекулярну масу, чим амілаза, і більш складну будову. Існує думка, що ланцюги амілопектину не роздвоюються, а утворюють симетричні потрійні і більш складні розходження, тоді молекула амілопектину набуває продовгувату форму, яка володіє великою компактністю в просторі.  Джерело азоту.           Для синтезу біомаси грибу Beauveria bassiana в якості джерела азоту використовують кукурудзяний екстракт. Кукурудзяний екстракт є джерелом органічного азоту, який засвоюється продуцентом. Таким органічним азотом є амінний азот і частково білковий.        Мінеральний склад середовища.      Середовища для вирощування Beauveria bassiana мають велику кількість джерел фосфору, магнію, заліза, кальцію, марганцю і інших мікроелементів.  Основною вимогою до компоновки поживного середовища для вирощування Beauveria bassiana є те, що воно повинно містити всі елементи, з яких складається клітина, причому в такій формі, в якій продуцент здатний їх засвоювати.

3.4.1.Розрахунок  складу поживного середовища

Скласти базове поживне середовище для вирощування грибу Beauveria bassiana – для виготовлення препарату захисту рослин Боверин.  Основною вимогою до поживного середовища є те, що воно повинно містити всі елементи з яких складається клітина, причому в такій формі, в якій мікроорганізми здатні її засвоювати [8].        До складу грибної клітини входять наступні елементи(в % до маси сухої речовини): вуглець – 50; кисень – 20; азот – 10-14; водень – 8; фосфор – 3; сірка, калій, натрій – 0,2; решта елементів – близько 0,3.   Мікроорганізмам для формування нової клітини необхідно надходження із навколишнього середовища різних поживних компонентів у доступній формі у визначених якісних і кількісних співвідношеннях. Всі елементи, які входять до складу клітини, повинні входити до складу поживного середовища.   Без наявності хоча б одного із вказаних елементів ріст буде незначним або його зовсім не буде.         Серед всіх елементів, що використовуються мікроорганізмами в якості поживних речовин, найбільш важливе значення має вуглевод, вміст якого у перерахунку на суху масу складає приблизно 50%. В якості вуглецевого живлення в даній технології виступає меляса – відход цукрової промисловості. Для розвитку мікроорганізмів, а відповідно, синтезу білкових речовин і побудови протоплазми живої клітини потрібні різні джерела азоту. Органічними джерелами азоту в цій технології є амоній молібденовокислий.

Розрахунок вмісту в середовищі джерела вуглецевого живлення

Потреби для синтезу біомаси. У  біомасі міститься 50% вуглецю, отже вміст вуглецю у 30 г біомаси  становить              30 × 0,5 = 15 г.         Ця кількість вуглецю міститься у             (15 × 162) / 72 = 33,75 г цукрів.

Враховуючи 40 % втрат субстрату  на «холосте окиснення», для одержання 30 г/л біомаси у середовище слід внести            (33,75 × 0,4) + 33,75 = 47,25 г/л крохмалю

Отже, загальний вміст крохмалю у середовищі, необхідний для синтезу  біомаси (30 г/л) становить 47,25 г/л .

Розрахунок вмісту органічного  азоту в кукурудзяному екстракті

      Припустимо, що в біомасі міститься 10% азоту.  Отже, у 30г біомаси вміст азоту  (за елементом N) становить 3г.        Кукурудзяний екстракт є джерелом органічного азоту, який засвоюється продуцентом. Таким чином азот є амінний азот і частково білковий. У ньому міститься 43% білків. Для хімічного складу білків характерний постійний середній вміст нітрогену – близько 16%.        Далі розрахуємо, у скількох грамах білку міститься 16г нітрогену.  Отже, у 100г білку міститься 16 г нітрогену, тоді 3 г нітрогену міститься в     (100 × 3) / 16 = 18,75 г білку.

Розрахунок вмісту фосфору у середовищі

У біомасі міститься близько 3 % фосфору (за елементом Р). Отже, для  синтезу 30 г/л біомаси вміст фосфору  у середовищі має становити 30 * 0,03 =0,9 г/л. Джерелами фосфору у промисловому виробництві Боверину є двозаміщений калій фосфорнокислий – К₂НРО₄.          Далі розрахуємо, у скількох граммах К₂НРО₄  міститься 0,9г фосфору.   Отже, 174 г - К₂НРО₄ міститься 31 г фосфору, тоді 0,9 г фосфору міститься в                  (174 × 0,9) / 31 = 5 г К₂НРО_4.

Розрахунок вмісту кальцію у середовищі

У біомасі міститься близько 0,5 % Са. Для синтезу 30 г/л біомаси  вміст кальцію в середовищі повинен  становити              30 × 0,005 = 0,15 г/л.      Кальцій у середовищі міститься в вигляді хлориду кальцію, молекулярна маса якого 111. У 111 г хлориду кальцію  міститься 40 г кальцію. Концентрація солі в середовищі становить             (0,15 × 111) / 40 = 0,42 г/л

Інші компоненти середовища.

     Джерелами  таких потрібних для росту  даної біомаси, як магній, кальцій  і залізо, кукурудзяний екстракт, хлорид натрію, хлорид марганцю, хлорид кальцію. Їх кількість вимірюють зазвичай в мікрограмах на літр.

3.5 Обґрунтування способу проведення біосинтезу

Культивування мікроорганізму може проводитись різними способами: глибинним чи поверхневим, періодичним  чи безперервним.   Спосіб проведення біосинтезу обирають експериментально.Гриб Beauveria bassiana – аероб. У рідких середовищах з великим об'ємом рідини аеробні бактерії можуть рости тільки на поверхні, оскільки з віддаленням від поверхні умови наближаються до анаеробних. Для нормального росту аеробів у глибоких шарах рідкої культури необхідна аерація. Процес вирощування даної культури проводять з аерацією і перемішуванням, тому її можна вирощувати у глибоких шарах.          Обираючи періодичний чи безперервний спосіб культивування, потрібно звертати увагу на переваги та недоліки цих процесів.     При вирощуванні мікроорганізмів періодичним способом відбувається велика затрата часу.          Метод безперервного культивування полягає в тому, що в ферментер, в якому вирощується бактерія, весь час надходить свіже поживне середовище і одночасно з такою самою швидкістю відводиться культуральна рідина, яка вміщує бактеріальні клітини та продукти метаболізму. За такого культивування можна якоюсь мірою наблизитись до ідеальної ситуації, коли клітини тривалий час перебувають у фазі експоненційного росту за постійної концентрації субстрату та інших незмінних умов [10].      Враховуючи ці дані, можна сказати, що оптимальним способом проведення культивування буде безперервний спосіб.    Гриб Beauveria bassiana є мезофільним мікроорганізмом, тому найкращою і оптимальною температурою культивування буде 25-28°С протягом всього процесу.           Важливим етапом процесу біосинтезу є вибір ферментера, оскільки від цього залежить продутивність процессу. Промислові ферментери, як правило, працюють в технологічному ланцюжку з посівними ферментаційними апаратами. В останніх готується посівна культура для виробничої ферментації. Слід пам'ятати, що продуктивність ферментера залежить від безлічі факторів, а не тільки від робочого об'єму. Іншими словами, зовсім не очевидно, що однакові за обсягом ферментер двох різних постачальників, будуть мати однакову продуктивність. Швидше навпаки, більш якісний і трохи більш дорогий ферментер, буде значно більше продуктивним, чим менш якісний і дешевий. Це досягається за рахунок багатьох причин, в тому числі і за рахунок більш ефективного проведення процесу ферментації.     Ефективність процесу ферментації визначається виходом продукту з 1 літра робочого об'єму ферментера. Вона залежить від багатьох факторів, в тому числі від конструкції ферментера і системи управління. Бажано, щоб устаткування виготовлялося і поставлялося з урахуванням особливостей технологічного процесу замовника. У ферментер повинні створюватися найбільш сприятливі умови для культури мікроорганізмів, сприяють здобуттю максимального виходу продукту ферментації. Ці умови визначаються процесами тепло- і масообміну, точним дозуванням необхідних технологічних добавок, чутливістю вимірювальних датчиків і можливостями системи управління. Проте жодна система управління не допоможе, якщо конструкція ферментера не може забезпечити асептику процесу культивування [1].   Для отримання високої ефективності процесу ферментації важливе значення має забезпечення стерильності. При зараженні промислової культури сторонньої мікрофлорою вихід продукту ферментації дорівнює нулю, а економічні втрати максимальні. Тому гарантованого забезпечення стерильності слід приділяти особливу увагу. Стерильність в сучасних ферментерах забезпечується цілим комплексом технічних засобів. Серед них:

- автоматична мийка ферментер на місці;

- подвійне механічне ущільнення валу мішалки;

- системи перевірки цілісності повітряних фільтрів;

- і т.д. [3].

 

 

 

 

 

 

 

          Розділ 4. Опис технологічного процесу біосинтезу грибу Beauveria bassiana

4.1. Характеристика  сировини, матеріалів та напівпродуктів

Таблиця 4.1.1.

Характеристика  сировини та  матеріалів [9] [10]

Наймену-вання	Категорія та номер НТД	Показники НТД, обов’язкові  для перевірки		Особливі властивості
1	2	3		4
Основна сировина
Кукурудзяний екстракт	ГОСТ 29048-91		Опис, зовнішній вид. колір, запах, смак, розчинність	Для приготування живильного середовища
Дріжджі кормові	ГОСТ 20083-74		Опис, зовнішній вид. колір, запах, смак, розчинність	Для приготування живильного середовища
Хлорид       Натрію	ГОСТ 4233-77		Опис, зовнішній вид. колір, запах,розчинність	Для приготування живильного середовища
Хлорид      марганцю	ГОСТ 612-75		Опис, зовнішній вид. колір, запах,розчинність	Для приготування живильного середовища
Хлорид         кальцію	ГОСТ 450-77		Опис, зовнішній вид. колір, запах,розчинність	Для приготування живильного середовища
К2НРО4	ГОСТ 2493-75		Опис, зовнішній вид. колір, запах,розчинність	Для приготування живильного середовища
MgSO4x7H2O	ГОСТ 4523-77		Опис, зовнішній вид. колір, запах,розчинність	Для приготування живильного середовища
FeSO4x7H2O	ГОСТ 4148-78		Опис, зовнішній вид. колір, запах,розчинність	Для приготування живильного середовища
Крохмаль	ГОСТ 7699-78		Опис, зовнішній вид. колір, запах,розчинність	Для приготування живильного середовища
Допоміжна сировина
Мило гос-подарське	ГОСТ 790-89		Зовнішній вигляд, маркування, пакування	Для санобробки рук
Спирт етиловий ректифіко-ваний 96%	ДФУ доп. 1, ст. 339		Опис, ідентифікація, прозорість, розчинність, кольоровість, кислотність  або лужність, домішки	Для обробки обладнання та устаткування
Матеріали
Вата медична гігроскопічна (хірургічна)	ГОСТ 5556-81		Паспорт постачальника, цілісність пакування	Для виготовлення пробок та заглушок