Лекции по "Вирусологии"

В процессе репродукции вирусов могут образовываться вирусные частицы с измененным генотипом, что является следствием изменчивости вирусов. К появлению вирусов - мутантов спонтанный мутагенез(ошибочное спаривание азотистых оснований). Мутации в вирусном геноме приводит к изменению определенного участка НК,а вместе с ним выпадению определенного признака у вируса. При этом такие вирусы называют мутантными. Различают четыре класса вирусов - мутантов:1. Вирусы с условно дефектными вирусными геномами-вирусные частицы с частично измененным генотипом, кот-е проявляется только при определенных внешних условиях. Подобные вирусы после мутации сохраняют свою патогенность,но  при определен условиях они не способны проявлять свои патогенные свойства. Эти условия могут касаться изменения t чувствительной клетки, при кот-й вирус вызывает патологический процесс, в редких случаях изменения спектра хозяев (чаше в сторону сужения).2. Дефектные интерферирующие частицы (ДИ- частицы)-вирусы с измененной НК, при этом вирус утрачивает способность к синтезу функциональных белков, в рез-те чего этот вирус становиться неспособным к собственной репродукции. При заражении клетки дефектными вирусными частицами совместно с полноценными вирусами ДИ- частицы способны к саморепродукции. Утилизируя для своей репликации продукты генов полноценных вирусов, ДИ- частицы угнетают репродукции вируса- помощника.3. Интеграционные вирусы с дефектным геномом-вирусы, кот-е в ходе репродукции включают в свой геномный аппарат отдельные гены клеток. Все интеграционные вирусы с дефектным геномом представлены исключительно вирусами семейства Rеtroviridae, включающие в свой геномный состав определенные гены клетки (onс- гены), вызывающие трансформацию нормальных клеток в опухолевые. 4. Вирусы-саттелиты- вирусы, кот-е для собственной репродукции требуют присутствия продуктов генома другого неродственного вируса. Такой тип репродукции свойственен отдельным вирусам семейства Parvoviridae, кот-е репродуцируются только при наличии аденовирусов. По хар-ру взаимодействия очень похожи на ДИ- частицы,но у последних взаимодействие происходит только между родственными вирусами.

Вирусы обладают способностью :-наследственности, что обеспечивает сохранность вирусов в биосфере;- изменчивости, что обеспечивает способность вирусов приспосабливаться к меняющимся условиям внешней среды.

При этом вирусы способны не только взаимодействовать с клеткой-хозяином, изменяясь и приспосабливаясь для осуществления собственной репродукции, но и между собой, обеспечивая сохранение и повышение собственного генетического потенциала.

Взаимодействие вирусов между собой может происходить только при заражении одной клетки несколькими вирусами (смешанная инфекция). При этом характер взаимодействия в условиях смешанной инфекции может быть генетический и негенетический.

Генетические взаимодействия:1. Кросс-реактивация - это тип рекомбинации между 2-мя вирусами, один из кот-х является неизмененным (интактным), а другой - мутантным инактивированным. При этом в ходе рекомбинации происходит восстановление активности инактивированного вируса в следствие замены дефектных генов нормальными от интактного вируса.2. Множественная реактивация. Представляет собой также тип рекомбинации, происходящий между двумя мутантными инактивированными вирусами. При этом, вирусы, взаимодействуя, передают друг другу недефектные гены с формированием полноценного генома. В обоих случаях реактивации образующиеся в процессе рекомбинации вирусные частицы называются вирусы-реактиванты.3.  Пересортировка генов. Это отдельный тип рекомбинации, происходящий между двумя родственными вирусами с сегментированными молекулами PНК. При этом происходит обмен либо целыми фрагментами РНК, либо отдельными генами, либо отдельными участками генов, однако в любом случае при рекомбинации участвует недефектный генетический материал.  Образующиеся в процессе рекомбинации вирусы называют вирусы-реассортанты 4.  Гетерозиготность - нестойкое объединение нуклеиновых кислот двух вирусов под одним капсидом. Образующиеся при этом вирусные частицы называют вирусы-гетерозиготы.

Неген-е взаим-я.1. Комплементация. При этом дефектный (мутантный) по функциональному белку вирус не способен к собственной репродукции и требует помощника. В этом случае вирусом - помощником может являться как родственный недефектный вирус, так и биол-ки неродственный вирус (лейкоз птиц и вирус саркомы Рауса).2. Неген-я реактивация. В случае проникновения в кл-ку вместе с полноценным живым вирусом дефектного по структурному белку инактивированного вируса возможна репродукция последнего. При этом живой вирус, используя собственные ферменты, раздевает инактивированный вирус, после чего начинается репликация его нуклеиновой кислоты.3. Фенотипическое смешивание (транскапсидация). Является разновидностью гибридизации, при которой полноценный геном одного вируса в процессе сборки заключается в белковую оболочку (капсид) другого вируса. В этом случае образующиеся вирусы-гибриды являются генетически полноценными, то есть содержат неизмененный геном исходного вируса.

При всех способах взаимодействия вирусов между собой явления, при которых происходит подавление активности одного вируса другим, условно называют интерференцией. Взаимодействия вирусов, при которых происходит повышение активности участвующих вирусов, называют экзальтацией.

8.Специальные методы  выделения и изучения вирусов.

Методы лабораторной диагностики вирусных инфекций:

1.Вирусоскопический метод исследования: а) в световом микроскопе(можно увидеть только крупные-вирус бешенства и оспы); б) в люминесцентном микроскопе( использ-т красители,кот-е вызывают свечение,использ спец лампа); в) в электронном микроскопе.

2. Выделение и культивирование вирусов путем заражения развивающихся куриных эмбрионов, лабораторных животных и культур клеток.

3. Серологический метод исследования (идентификация вирусов) - постановка серологических реакций (РЗГА, PH и др.).

4. Биологический метод.

1.При вирусоскопическом методе в исследуемом материале обнаруживают с помощью электронной микроскопии вирионы или с помощью светооптической микроскопии внутриклеточные включ-я(тельца Гуарниери в кл-ке, зараженной вирусом оспы; включ-я в цилиндрич эпителии, зараженном вирусом гриппа;включ-я в эпителии, зараженном реовирусом;тельца Бабеша-Негри в нейроцитах). Люминесцентная микроскопия-флуорохромирование - это обработка препарата одним или неск флуорохромами с целью увелич-я силы и контрастности свечения.Использ-ся для: 1) обнаружения крупных вирусов; 2) выявления внутриклеточных включений; 3) излучения ЦПД вируса в культуре клеток; 4) определения типа НК вируса. 2 способа применения этого метода: прямой и непрямой.

2.  Культивирование вирусов путем заражения развивающихся куриных эмбрионов (РКЭ) .Преимущ-ва РКЭ перед др живыми системами:1) это закрытая живая система. Скорлупа и подскорлуповая оболочка надежно защищают эмбрион от бактериального заражения; 2)у РКЭ высокая чувствительность к широкому спектру вирусов (недостаточное развитие защитных механизмов); 3) РКЭ - легкодоступный объект; 4)РКЭ - экономичная живая система, не требующая ухода и кормления; 5)РКЭ не образуют антител в ответ на заражение. 

Куриные эмбрионы(КЭ) используют в вирусологии для: 1)обнаружения в патматериале активного вируса или первичного выделения вируса. Эффективно выд-ют и культивируют на КЭ вирусы, вызыв-щие заболевания у птиц, некот млекопит; 2) поддержания вирусов в условиях лаборатории; 3)титрования вирусов; 4)накопления вируса для лабор исследований и получения вакцин; 5)р-ции нейтрализации как тест-объект.

3.Биологический метод .Исп-ют животных для: 1)обнаружения вируса в патматериале; 2)первичного выделения вируса из патматериала; 3)накопления вирусной массы; 4)поддержания вируса в активном состоянии; 5)титрования вируса; 6)в качестве тест-объекта в реакции нейтрализации; 7)получения гипериммунных сывороток. Принципы титрования вирусов:

Титр вируса-это конц-я вирусных частиц в ед объема(V) материала. Измеряют в ед действия или в ед активности(инфекционные ед- ед локальных повреждений, вызываемые вирусом и оцениваемые по единичному эффекту).Из локальных повреждений: 1) бляшки в зараженных культурах клеток-островки мертвых клеток в слое живых); 2) оспины-некротические узелки на хорион-амниотической оболочке куриных эмбрионов.

1БОЕ(бляшкообразующая ед)-доза вируса, способная образовть 1 бляшку, 1 ООЕ(оспинообразующ ед.)-образ 1 оспину.

Необходимо знать точный V исслед вирусного материала, им заражают ч/л, затем подсчитывают бляшки или оспины.

4.Серологический метод. Основа этих р-ций лежит на индикации вирусных гемм-агглютининов. Гемагглютинация- реакция склеивания эритроцитов (РГА).РГА неспецифична. Механизм состоит в адсорбции вируса на поверхности эритроцитов в рез-те физ-хим процессов, зависящих от разности зарядов и сил межмолекулярн притяжения. Эритроциты склеиваются и выпадают в осадок.

9. Неклеточные формы-бактериофаги, прионы, вироиды, сателлиты, плазмиды.

Бактериофаги.(Фаги) способны проникать в бактериальную клетку и разрушать ее.  Тело фага кишечной палочки состоит из головки, от которой отходит полый стержень, окруженный чехлом из сократительного белка. Стержень заканчивается базальной пластинкой, на которой закреплены шесть нитей. Внутри головки находится ДНК. Бактериофаг при помощи отростков прикрепляется к поверхности кишечной палочки и в месте соприкосновения с ней растворяет с помощью фермента клеточную стенку. После этого за счет сокращения головки молекула ДНК фага впрыскивается через канал стержня в клетку. Примерно через 10—15 мин под действием этой ДНК перестраивается весь метаболизм бактериальной клетки, и она начинает синтезировать ДНК бактериофага, а не собственную. При этом синтезируется и фаговый белок. Завершается процесс появлением 200— 1 000 новых фаговых частиц, в результате чего клетка бактерии погибает.

Прионы— белковые инфекционные агенты, не содержащие нуклеиновых кислот и вызывающие ряд заболеваний нервной системы человека и животных. Человек может заразиться прионами, содержащимися в пище. При определенных условиях в организме человека может произойти спонтанная трансформация прионового протеина в прион. Так возникает так называемая спорадическая болезнь Крейтцфельдта-Якоба. Прионы могут проникать в тело и парентеральным путем при внутримышечном введении препаратов, изготовленных из человеческих гипофизов, а также при нейрохирургических операциях  через инструменты. Инфекционное воздействие прионов связано с патогенной конформацией их белковой молекулы. Прионный белок, обладающий аномальной трехмерной структурой, способен прямо катализировать структурное превращение гомологичного ему нормального клеточного белка в себе подобный, присоединяясь к белку-мишени и изменяя его конформацию. Пораженная нервная ткань приобретает губчатую структуру, утрачивает способность выполнять свои функции. В результате развивается болезнь губчатая энцефалопатия, приводящая к гибели организма. Прионы обладают высокой устойчивостью.

Вироиды— мельчайшие инфекционные агенты, представляющие собой низкомолекулярную одноцепочечную кольцевую РНК, не кодирующую собственные белки. Отсутствует у них капсид. Виройдная  РНК не кодирует собственные белки. Вироиды вызывают различные заболевания растений, такие как веретеновидность клубней, карликовость, утонченность покровов, обводненность тканей пораженного растения и т. д. переносчиками  вироидов являются питающиеся  клеточным соком насекомые (например, тли) и некоторые паразиты растений (например, круглые черви).

Сателлиты — вирусные частицы, неспособные строить капсиды самостоятельно. Они инфицируют клетки, для которых несвойственна естественная смерть от старости (например, амёбы, бактерии). Когда клетку, заражённую вирусом-сателлитом, заражает обычный вирус, то вирус-сателлит нарушает производство вирионов этого вируса и сам начинает размножаться. Вирусы-сателлиты, по сути, являются гиперпаразитами.

Плазмидывнехромосомные (дополнительные по отношению к хромосоме) генетические структуры бактерий, способные автономно размножаться и существовать в цитоплазме бактериальной клетки. Некоторые плазмиды могут с определенной частотой включаться (интегрироваться) в бактериальный геном и размножаться (копироваться) затем вместе с ним как его составная часть.  Плазмиды представляют собой молекулы ДНК с молекулярной массой от 1×106 до 200×106. Замкнуты в кольцо и находятся в клетке в сверхспирализованной форме.

10. Бактериофаги- форма фаговых вирионов, строение, многообразие, жизненный цикл, три состояния

Бактериофаги - это вирусы-паразиты бактерий. 

Различают простые и сложные фаги. При этом простые имеют форму шестигранников (колифаги MS-2, f2, фХ174) или нитей (фаги fl, fd), а сложные (колифаги группы Т1-Т7) - сперматозоидную. 

Фаги, как и вирусы позвоночных, беспозвоночных и растений, по содержанию нуклеиновых кислот подразделяются на ДНК- и РНК-содержащие, а по характеру взаимодействия с бактериями - на вирулентные и умеренные с полноценным и дефектным геномами.

У наиболее изученного сложного фага Т2 различают следующие структуры: шестигранную головку; воротничок; отросток, состоящий из полого стержня, снаружи покрытого сократительным чехлом; шестиугольную базальную пластинку с отходящими от каждого угла нитями. Диаметр головки в среднем составляет 50 нм, а отростка - 100-200 х 10-15 нм.

Жизненный цикл: Умеренные и вирулентные бактериофаги на начальных этапах взаимодействия с бактериальной клеткой имеют одинаковый цикл.

Адсорбция бактериофага на фагоспецифических рецепторах клетки.