Лекции по "Вирусологии"

Инъекция фаговой нуклеиновой кислоты в клетку хозяина.

Совместная репликация фаговой и бактериальной нуклеиновой кислоты.

Деление клетки. Далее бактериофаг может развиваться по двум моделям: лизогенный либо литический путь.  Умеренные бактериофаги после деления клетки находятся в состоянии профага (Лизогенный путь). Вирулентные бактериофаги развиваются по Литической модели: Нуклеиновая кислота фага направляет синтез ферментов фага, используя для этого белоксинтезирующий аппарат бактерии. Фаг тем или иным способом инактивирует ДНК и РНК хозяина, а ферменты фага совсем расщепляют её; РНК фага «подчиняет» себе клеточный аппарат синтеза белка. Нуклеиновая кислота фага реплицируется, и направляет синтез новых белков оболочки. Образуются новые частицы фага в результате спонтанной самосборки белковой оболочки (капсид) вокруг фаговой нуклеиновой кислоты; под контролем РНК фага синтезируется лизоцим. Лизис клетки: клетка лопается под воздействием лизоцима; высвобождается около 200—1000 новых фагов; фаги инфицируют другие бактерии.

Бактериофаг может существовать в трех состояниях профага, вегетативного фага и зрелого фага. В зрелом состоянии фаги существуют вне клетки - хозяина, метаболически они инертны и несколько напоминают споры бактерий. После адсорбции на клетке-хозяине часть фаговой частицы проникает внутрь клетки, где начинает размножаться. Такая размножающаяся внутри клетки частица отличается во многих отношениях от зрелого фага; ее называют вегетативным фагом вследствие присущей ей почти безграничной способности к воспроизведению. Некоторые фаги, названные умеренными, характеризуются способностью существовать в третьем состоянии, а именно в состоянии профага. Инфицируя чувствительную бактериальную клетку, зрелая частица умеренного фага может переходить либо в вегетативное состояние, ведущее к разрушению клетки - хозяина, либо в состояние профага, который входит в наследственно закрепленные симбиотические взаимоотношения с клеткой-хозяином, известные под названием лизогении. Мы говорим здесь о симбиозе, а не о паразитизме, так как легко заметить, что лизогения способствует выживанию и фага, и клетки - хозяина.

11. Особенности взаимодействия  с клеткой вирулентных и умеренных  фагов. 

Вирулентные фаги, проникнув в бактериальную клетку, автономно репродуцируются в ней и вызывают лизис бактерий. Процесс взаимодействия вирулентного фага с бактерией протекает в виде нескольких стадий.Фаги адсорбируются на поверхности бактериальной клетки с помощью фибрилл хвостового отростка. В результате активации фагового фермента АТФазы происходит сокращение чехла хвостового отростка и внедрение стержня в клетку. В процессе «прокалывания» клеточной стенки бактерии принимает участие фермент лизоцим, находящийся на конце хвостового отростка. Вслед за этим ДНК фага, содержащаяся в головке, проходит через полость хвостового стержня и активно впрыскивается в цитоплазму клетки. Остальные структурные элементы фага (капсид и отросток) остаются вне клетки.

После биосинтеза фаговых компонентов и их самосборки в бактериальной клетке накапливается до 200 новых фаговых частиц. Под действием фагового лизоцима и внутриклеточного осмотического давления происходит разрушение клеточной стенки, выход фагового потомства в окружающую среду и лизис бактерии. Один литический цикл (от момента адсорбции фагов до их выхода из клетки) продолжается 30—40 мин. Процесс бактериофагии проходит несколько циклов, пока не будут лизированы все чувствительные к данному фагу бактерии.

Умеренные фагилизируют не все клетки в популяции, с частью из них они вступают в симбиоз, в результате чего ДНК фага встраивается в хромосому бактерии. В таком случае геномом фага называют профаг. Профаг, ставший частью хромосомы клетки, при ее размножении реплицируется синхронно с геном бактерии, не вызывая ее лизиса, и передается по наследству от клетки к клетке неограниченному числу потомков.

Биологическое явление симбиоза микробной клетки с умеренным фагом (профагом) называется лизогенией, а культура бактерий, содержащая профаг, получила название лизогенной. Это название отражает способность профага самопроизвольно или под действием ряда физических и химических факторов исключаться из хромосомы клетки и переходить в цитоплазму.

 Лизогенные культуры посвоим  основным свойствам не отличаются  от исходных, но они невосприимчивы  к повторному заражению гомологичным  или близкородственным фагом  и, кроме того, приобретают дополнительные  свойства, которые находятся под  контролем генов профага. Изменение  свойств микроорганизмов под  влиянием профага получило название  фаговой конверсии. Последняя имеет  место у многих видов микроорганизмов  и касается различных их свойств: культуральных, биохимических, токсигенных, антигенных, чувствительности к  антибиотикам и др. Кроме того, переходя из интегрированного  состояния в вирулентную форму, умеренный фаг может захватить  часть хромосомы клетки и при  лизисе последней переносит эту  часть хромосомы в другую клетку. Если микробная клетка станет  лизогенной, она приобретает новые  свойства. Таким образом, умеренные  фаги являются мощным фактором  изменчивости микроорганизмов.

12. Генетическая  организация и особенности репликации  умеренных фагов. Механизм лизогенизации  и индукции профага

Наряду с вирулентными существуют умеренные фаги, взаимодействие которых с бактериями проявляется в двух формах: одни штаммы или клетки определенного вида бактерий они разрушают, в другие проникают, но гибели не вызывают. В последнем случае ДНК умеренного фага образует кольцо и с помощью репрессоров, кодируемых вирусным геномом, прерывается ее способность к автономной репликации, что заканчивается интеграцией с геномом бактерии. В дальнейшем ген. материал фага воспроизводится вместе с бактериальным геномом при делении клетки.

Умеренный фаг, наследственные детерминанты которого объединились с бактериальными, называется профагом; бактерии, содержащие профаг, - лизогенными, а само явление – лизогенией.

Частоту отщепления профага от бактериальной хромосомы можно увеличить, воздействуя на лизогенные бактерии УФ лучами, ионизирующей радиацией и химическими мутагенами (индукция лизогенных бактерий). Нами доказано индуцирующее действие магнитных полей на лизогенные системы. При отщеплении профаг переходит в вегетативную (размножающуюся) форму и лизирует клетку. Выделившиеся фаговые частицы не способны к репродукции в лизогенных по тому же фагу бактериях, но могут вызывать лизис нелизогенных или лизогенных по другим фагам родственных клеток. Изредка лизогенные бактерии утрачивают фаг без перехода его в вегетативную форму. Иногда в состоянии лизогенности у бактерий появляются новые признаки и свойства, кодируемые геномом фа га. Изменчивость, формирующаяся под влиянием профага, получила название фаговой конверсии. При индукции лизогенных бактерий в профаг нередко включаются гены бактерий, но чаще они замещают некоторую часть того его участка ДНК, которая остается в геноме бактериальной клетки. Утратившие часть своего генома умеренные фаги становятся дефектными и, будучи не способными к образованию зрелых частиц, осуществляют трансдукцию, т. е. перенос генов

13. Фаговая трансдукция  и фаговая конверсия. 

Трансдукция - перенос генетического материала из одной клетки в другую с помощью вируса, что приводит к изменению наследственных свойств клеток-реципиентов. Явление Особые бактериальные вирусы — умеренные фаги в процессе вегетативного размножения способны случайно захватывать и переносить в др. клетки любые участки ДНК лизируемых, то есть разрушаемых ими, бактерий. Длина переносимого (трансдуцируемого) отрезка ДНК определяется размером белковой оболочки фаговой частицы и обычно не превышает 1—2% бактериального генома. Переносимый отрезок может содержать несколько генов. Поскольку вероятность такой сцепленной Т. зависит от расстояния между генами в молекуле ДНК, образующей хромосому бактерии, явление Т. широко используется при составлении генетических карт хромосом бактерий. Генетический материал фага в таких трансдуцирующих частицах отсутствует; поэтому, вводя ДНК в клетку, они не осуществляют все остальные функции фага: не размножаются, не лизогенизируют клетку и не наделяют её иммунитетом к фагу. Внесённый фрагмент может существовать в клетке в виде дополнительной генетического элемента, обладающего функциональной активностью. Поскольку такой фрагмент не способен воспроизводиться, при каждом клеточном делении он передаётся лишь в одну из дочерних клеток. За исключением этой клетки свойства всего остального потомства остаются без изменений (абортивная Т.). В дальнейшем фрагмент может быть либо разрушен, либо включен в хромосому бактерии, заменив в ней гомологичный участок ДНК. В последнем случае новые признаки, приобретённые клеткой-трансдуктантом, будут свойственны всему потомству этой клетки (полная Т.).

Фаговая конверсия — это изменение фенотипа бактериальной клетки (антигенной характеристики, токсинообразования, чувствительности к другим фагам и т. п.), обусловленное включением вее хромосому генома умеренного фага.

14. Бактериофаги как переносчики  генетической информации бактерий. Использование фагов в генетической  инженерии в качестве векторов  генетической информации

Бактериофаги представляют собой один из основных подвижных генетических элементов. Посредством трансдукции они привносят в бактериальный геном новые гены. Было подсчитано, что за 1 секунду могут быть инфицированы 1024 бактерий . Это означает, что постоянный перенос генетического материала распределяется между бактериями, обитающими в сходных условиях.

Высокий уровень специализации, долгосрочное существование, способность быстро репродуцироваться в соответствующем хозяине способствует их сохранению в динамичном балансе среди широкого разнообразия видов бактерий в любой природной экосистеме. Когда подходящий хозяин отсутствует, многие фаги могут сохранять способность к инфицированию на протяжении десятилетий, если не будут уничтожены экстремальными веществами либо условиями внешней среды.

Одной из областей использования бактериофагов является антибактериальная терапия, альтернативная приёму антибиотиков. Например, применяются бактериофаги: стрептококковый, стафилококковый, клебсиеллёзный, дизентерийный поливалентный, пиобактериофаг, коли, протейный и колипротейный и другие.

Бактериофаги применяются также в генной инженерии в качестве векторов, переносящих участки ДНК, возможна также естественная передача генов между бактериями посредством некоторых фагов (трансдукция). Фаговые векторы обычно создают на базе умеренного бактериофага λ, содержащего двухцепочечную линейную молеклул ДНК. Левое и правое плечи фага имеют все гены, необходимые для литического цикла (репликации, размножения). Средняя часть генома бактериофага λ (содержит гены, контролирующие лизогению, то есть его интеграцию в ДНК бактериальной клетки) не существенна для его размножения и составляет примерно 25 тысяч пар нуклеотидов. Данная часть может быть заменена на чужеродный фрагмент ДНК. Такие модифицированные фаги проходят литический цикл, но лизогения не происходит. Векторы на основе бактериофага λ используют для клонирования фрагментов ДНК эукариот (то есть более крупных генов) размером до 23 т.п.н. Причем, фаги без вставок — менее 38 т.п.н или, напротив, со слишком большими вставками — более 52 т.п.н не развиваются и не поражают бактерии

16. Репликация вирусов, общая  схема, стадии

Стадии и фазы репродукции вирусов

Репродукциея - процесс размножения вир. частиц в чувствит-х к ним кл-х. Репродуцир-ся в них не все вирусы, а только вирулентные, обладающие высокой степенью патогенности.

В цикле репродукции вирусов различают четыре стадии:

1) подготовительную, или инициальную, включающую фазы адсорбции вируса на кл., проникновения и раздевания в клетке;

2) собственно репродуктивную стадию  образования структурных белков и вирионных НК; 3) сборку вирионов;

4) заключительную, сопровождающуюся выходом зрелых вирусных частиц из клетки.

Подготовительная стадия репродукции. Взаимодействие вирусов с клетками определяется наличием у них специфических рецепторов. С них и начинается «узнавание» вирусом чувствительных клеток. По хим.структуре рецепторы разнородны - молекулы-белки, углеводные или липидные компоненты протеидов. Адсорбция – рецептор кл. должен связаться с антирецептором вир. Фаза проникновения вируса в цитоплазму кл. реализуется двумя способами - пассивным путем виропексиса или активным путем слияния (интеграции) вирусной оболочки с клеточной мембраной.  Виропексис - вирус проникает в клетку путем впячивания мембраны с образованием вокруг него вакуоли, не требует спец.белков вируса кроме антирецептора. Слияния вирусной оболочки с клеточной мембраной происходит на пов-ти кл. или следом за эндоцитозом в цитоплазматич.вакуоле и необходим белок слияния в оболочке вируса, под действием кот. происх-т объединение оболочки вир.с мембраной кл. В рез-те вир.оболочка и встроенный в нее белок стан-ся частью мембраны кл., а капсид с НК проник-ет в цитопл.и выз-ет инфекцию.

Фаза раздевания – отдел-е белка вир. от НК для дальнейшей экспрессии. Конечными продуктами раздевания у ряда вирусов явл. НК, связанные с внутренним вирусным белком, нуклеокапсидом или сердцевиной. Репродуктивная стадия включ-ет: транскрипцию, трансляцию и репликацию. Транскрипция – перепис-е НК вирусов на иРНК. Трансляция – синтезир-я вирусн.белок, начин-ся с узнавания клеточн-ми рибосомами вир. иРНК. Репликация : у ДНК-содержащих вирусов синтез гомологичн.НК осущ-ся на обеих расплетенных цепях, в рез-те чего каждый вновь образ-ся вирион получает  ДНК состоящую из старой цепи и ее новой копии.  Осущ-ся ДНК-полимеразами. Реплик-я вирусн.РНК происходит на промежуточных комплиментарных нитях, т.е. образованию новых предшествует синтез их двойников. Осущ-ют репликазы. Вновь синтезированная  геномная РНК может служить матрицей для синтеза новых ее копий, т.е. войти в состав вириона и функц-ть как иРНК. Вирусные компоненты синтезир-ся неодновременно и в разн.местах – дисъюнктивный способ репродукции. Сборка вирионов: у простых вирусов-белок нуклеиновой сборки,  у сложных вир.сборка происх-т поэтапно. Самыми первыми  формир-ся сердцевина и синтезир-ся суперкапсид белков. Конечн. этап – выход вирионов из инфицированных кл., м.б. отпочковыванием и разруш-ем кл.  Особенности реплик-ции генома: 1) использ-е клеточной белоксинтезир-ей системы для синтеза вир.белков 2) коет.транскриптазу для синтеза мРНК могут использ-ть только ДНК-геномные вир. 3) все вир.создают собственные фер-ты для синтеза 4) вир-ся синтезир. индивид-е мРНК для каждого гена.