Методы дезинтеграции

У грамположительных микроорганизмов клеточная стенка состоит из толстого пептидогликанового слоя N –ацетилглюкозамина и остатков N – ацетилмурамовой кислоты, соединенных пептидными мостиками. У грамотрицательных бактерии клеточная стенка тоньше и покрыты снаружи слоем липидов. Стенка дрожжевых клеток состоит из плотного слоя частично фосфорилированных маннатов и β – глюканов. Низшие грибы имеют многослойные клеточные стенки, состоящие из α и β глюканов, гликопротеидов и хитина.

Основные функции клеточной стенки следующие.

 • Клеточная стенка защищает  бактерии от внешних воздействий, придаёт им характерную форму, поддерживает постоянство внутренней  среды и участвует в делении.

 • Через клеточную стенку  бактерий осуществляется транспорт  питательных веществ и выделение  метаболитов.

 • На поверхности клеточной  стенки располагаются рецепторы для бактериофагов, бактериоцинов и различных химических веществ.

• Структура и состав элементов клеточной стенки определяет антигенную характеристику бактерий (по структуре О- и Vi-Аг).

• Клеточная стенка способна по-разному воспринимать красители; на этом основаны тинкториальные свойства бактерий.

 • Нарушение синтеза компонентов  клеточной стенки приводит к  гибели бактерии или образованию 1-форм.

2. Понятие дезинтеграции клеток и её цели.

 

Дезинтеграция - разрушение клеток с помощью механического, физического, химического или иного воздействия с целью выделения их содержимого (напр., экстрагирования нуклеиновых кислот, белков и др.)

Дезинтеграция клеток применяется во многих сферах жизни человека, в частности в биотехнологии, для извлечения целевого продукта синтеза из биомассы.

Если продукт локализован внутри клеток, их разрушают, удаляют клеточные осколки и выделяют продукты из осветленной среды; секретируемый продукт выделяют непосредственно из среды.

Для отделения биомассы клеток или культуральной жидкости используют сепараторы, осадительные центрифуги, фильтр – прессы, вакуум – барабанные фильтры, ротационно-вакуумные фильтры, отстойники. Выбор оборудования зависит от масштаба культирования, типа клеток, свойства культуральной жидкости.

Для выделения клеток из больших объемов культуральной среды (в промышленных масштабах) используют высокоскоростное центрифугирование с помощью соответствующих центрифуг полунепрерывного действия. Суспензию клеток непрерывно подают в барабан центрифуги, клетки концентрируются в нем, осветленная жидкость удаляется. Когда барабан заполняется осажденными клетками, центрифугу останавливают и клетки собирают. Неудобства этого способа – необходимость остановки процесса, вероятность утечки микроорганизмов окружающих среду, невозможность полного удаления клеток и среды.

Альтернативный метод выделения клеток из культуральной среды – фильтрация через мембрану. Но процесс фильтрации быстро замедляются за счет накопления клеток на поверхность фильтра. Увеличение давления фильтруемой среды дает временный эффект, так как клетки забивают поры, образуя менее проницаемый слой.

Завершающие стадии биотехнологических процессов – выделение целевого продукта – существенно различаются в зависимости от того, накапливается продукт в клетке или он выделяется в культуральную жидкость, или же продуктом является клеточная биомасса. Наиболее сложным является выделение внутриклеточного продукта. При этом клетки необходимо отделить от среды культивирования, подвергнуть их разрушению, а затем целевой продукт очистить от остатков разрушенных клеток.

Выделение продукта существенно облегчается, если он экскретируется продуцентом в культуральную жидкость. Поэтому одной из насущных задач биотехнологии является создание промышленных штаммов микроорганизмов, секретирующих возможно большее число ценных продуктов в значительных количествах.

Технология выделения и очистки в значительной степени определяется природой целевого продукта. В ряде случаев существует возможность не использовать тщательную очистку продукта, если он обладает требуемыми активностями в неочищенном состоянии и если примесь посторонних веществ не оказывает каких-либо нежелательных влияний при его использовании. Некоторые традиционные биотехнологические процессы вообще исключают этап отделения продукта.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

3.Методы  дезинтеграции клеток

Для дезинтеграции клеток применяют разнообразные методы. Все процедуры должны быть одновременно достаточно жесткими, чтобы разрушить клеточную стенку, и достаточно мягкими для исключения денатурации белка (изменения структуры конечного продукта).

Все методы дезинтеграции можно поделить на физические, химические и химико - ферментативные.

 

3.1 Физические методы

К физическим методам дезинтеграции относятся: обработка ультразвуком, вращение лопасти или вибратора, баллистическое разрушение, продавливание с помощью пресса, измельчение твердой замороженной клеточной массы, осмотический шок, замораживание-оттаивание, декомпрессия (сжатие с последующим резким снижением давления).

 

• Обработка ультразвуком

Обработка ультразвуком является эффективным средством для разрушения клеточных структур. Этот эффект может быть использован для извлечения внутриклеточных материалов, например, крахмала из матричной клетки.

Ультразвуковая обработка попеременно генерирует волны высокого и низкого давления в обрабатываемой жидкости. Во время цикла низкого давления ультразвуковые волны создают мелкие вакуумные пузырьки, которые с силой лопаются во время цикла высокого давления. Данное явление носит название кавитации. Внутренний взрыв кавитационных пузырьков вызывает возникновение сильных гидродинамических сил сдвига.

Силы сдвига разделяют волокнистый клеточный материал на мелкие частицы и разрушают стенки клеточной структуры, высвобождая, тем самым, много внутриклеточного материала. Помимо этого, материал стенок клетки разрушается на мелкие осколки.

Данный эффект может быть использован для ферментации, выщелачивания и других процессов преобразования органических веществ. После размола и измельчения ультразвуковая обработка создаёт больше внутриклеточного материала; при этом в ферментах образуется осколки стенок клеток, которые преобразуют крахмал в сахарозу. Он также увеличивает площадь поверхности, подвергаемую воздействию ферментов во время разжижения или сахарообразования. Обычно это увеличивает скорость и выход дрожжевого брожения и других преобразовательных процессов.

 

 

• Вращение лопасти или поршня

Блендеры, как правило, имеют режущие лопасти, вращающиеся с большой скоростью. Количество и конструкция этих лопастей бывают разными, но все они обычно заострены под прямым углом друг к другу, а форма их обеспечивает хорошее перемешивание содержимого сосуда. Суспензию клеток помещают в специальный стакан, который имеет по всей высоте раструбы и в поперечном сечении выглядит как клеверный лист. Для поддержания низкой температуры в процессе гомогенизации стакан помещают в лед. Благодаря особому расположению лопастей и конструкции стакана в ходе фракционирования возникают гидродинамические силы. Метод достаточно универсален и широко применяется для фракционирования клеток, однако следует иметь в виду, что при быстром вращении лопастей гомогенизаторов возникают некоторые нежелательные эффекты.

Большинство гомогенизаторов преставляют собой прибор, состоящий из пестика с ручным (гомогенизаторы Даунса и Тёнбрэка) или механическим (гомогенизатор Поттера--Эльвегёйма) приводом, который вращается или движется вверх и вниз в стеклянном цилиндрическом сосуде. Необходимо следить за тем, чтобы зазор между пестиком и стенками сосуда оставался постоянным, так как скорость разрушения клеток зависит не только от скорости вращения пестика, но и от соотношения между радиусами пестика и сосуда. Сосуд закрепляется неподвижно, поэтому скорость вращения суспензии изменяется от минимальной у его стенок до максимальной у поверхности пестика. Следовательно, чем меньше расстояние между этими поверхностями, тем выше градиент скорости. Возникающие при высоких скоростях силы достаточны для разрушения довольно тонких мембран животных клеток. Растительные и бактериальные клетки при этом не разрушаются.

• Баллистическое разрушение

Термином «баллистическое разрушение» обозначают разнообразный набор методов, в которых бактерии разрушаются силами сдвига, развивающимися, когда суспензия клеток очень сильно встряхивается или перемешивается вместе с маленькими стеклянными или пластмассовыми шариками

Ранее широко применялись два устройства - аппарат Микля для встряхивания и аппарат для встряхивания, насаживаемый на ось центрифуги типа International. Ни в одном из них не обеспечивалось поддержание низкой температуры во время встряхивания, и поэтому приходилось часто прерывать процесс для охлаждения пробы. Эти устройства больше не выпускаются промышленностью, они заменены тканевым дезинтегратором Брауна (Braun MSK; В. Braun Melsungen Apparatebau, Melsungen, Federal Republic of Germany), который поставляется в США многими фирмами, специализирующимися на выпуске лабораторного оборудования. Дезинтегратор Брауна имеет контейнер для пробы объемом 65 мл, который качается в горизонтальной плоскости с частотой 2000—4000 колебаний/мин. Охлаждение обеспечивается струей жидкого СО2, направляемой к контейнеру с пробой. В большинстве случаев клетки разрушаются за 3-6 мин при температуре ниже 4 °С.

Дезинтегратор Брауна применяют, если требуется выделить клеточные стенки и отдельные ферменты из грамположительных бактерий. Как правило, при этом пользуются методикой Ворка: суспензию клеток (30 мл с содержанием сухого вещества 20 - 50 мг/мл) в подходящем буфере смешивают с 20 мл шариков Ballotini № 12 в соответствующем контейнере (для воздуха важно оставить не меньше 20% объема емкости) и в течение 0,5 мин для охлаждения контейнера через аппарат пропускают СО2. Затем в течение 3,5 - 5 мин в зависимости от типа клеток пробу встряхивают с частотой 3000 движений в минуту. Шарики удаляют низкоскоростным центрифугированием или пропусканием смеси через грубый стеклянный фильтр. Некоторые исследователи предпочитают использовать вместо стеклянных шариков пластмассовые, чтобы свести к минимуму денатурацию ферментов. Если описанную выше методику применяют для выделения клеточных стенок, то пробу после встряхивания немедленно подвергают обработке, обеспечивающей инактивацию автолитических ферментов.

 

• Замораживание—оттаивание

Замораживание - оттаивание используют для того, чтобы сделать грамотрицательные клетки чувствительными к лизоциму или детергентам. Этот метод можно применять при выделении мембран или внутриклеточных органелл в больших количествах.

Для выделения больших количеств мембран полезна следующая методика. Густую суспензию отмытых клеток (клетки составляют около 30% объема суспензии) в 0,02 М трис-буфере, pH 7,8, содержащем 5 мМ ЭДТА, 0,25 М сахарозы и 0,5 мг/мл лизоцима, помещают в колбу и замораживают в виде тонкого слоя, вращая колбу в ацетоновой бане с сухим льдом. Затем суспензию размораживают, погружая колбу в теплую воду, и, как только все растает, выливают содержимое в 20 объемов холодного буфера, имеющего состав: 0,02 М трис, 0,5 мМ MgCl2, 0,1 мг/мл дезоксирибонуклеазы, pH 7,8. Смесь немедленно обрабатывают около 20 с в ножевом микроизмельчителе, чтобы измельчить ДНК и разрушить клетки.

Неразрушившиеся клетки удаляют центрифугированием в течение 5 мин при 5000 g. Если осадка много, его вновь суспендируют в указанном выше растворе трис-ЭДТА-сахарозы и повторяют цикл замораживания - оттаивания с последующим разведением.

 

• Продавливание с помощью пресса

 

Продавливание с помощью пресса представляет собой, вероятно, самый распространенный и самый полезный метод разрушения клеток. Некоторое количество бактериальной суспензии (объемом 5-40 мл с содержанием клеток до 30 об. %) помещают в стальной цилиндр с плотно пригнанным поршнем, имеющим маленький выпускной клапан с узким отверстием; с клапаном соединена выводящая трубка. Цилиндр с поршнем ставят под 10-тонный гидравлический пресс. По мере того как поршень опускается, клетки разрушаются большими гидродинамическими силами, возникающими при прохождении клеточной суспензии через отверстие выпускного клапана. У этого метода есть ряд преимуществ.

 Во- первых, нет проблемы с охлаждением, так как цилиндр и поршень пресса охлаждают заранее, а нагрев происходит только при прохождении клеток через отверстие клапана. Температура вытекающей жидкости повышается на 5—10 °С, но эту жидкость можно быстро охлаждать, если собирать в металлическую пробирку или стакан, помещенные в ледяную баню.

Во-вторых, разрушение происходит практически мгновенно, и суспензия разрушенных клеток не подвергается дополнительным гидродинамическим воздействиям, которые могли бы повредить субклеточные частицы.

В-третьих, при использовании гидравлического пресса удовлетворительного качества можно проводить эксперименты в хорошо воспроизводимых условиях. К тому же на степень разрушения не влияет плотность клеточной суспензии, фаза роста, в которой были собраны клетки, или среда, в которой клетки суспендированы.

Установка типа пресса Френча состоит из цилиндра, поршня, выпускного клапана и подающей нагрузку станины (American Instrument Co. [Aminco], Rockville, MD.). В старых моделях этого пресса использовали быстро изнашивающийся клапан со стальной иглой, который часто повреждался во время работы. Вместо него можно использовать выпускаемый сейчас клапан с подогнанным по размеру нейлоновым шариком (Aminco). Он позволяет поршню доходить до дна цилиндра, не вызывая повреждений, и обеспечивает более однородное разрушение. Удобен также гидравлический пресс с приводом от мотора; пресс можно устанавливать на постоянное усилие в диапазоне скоростей движения поршня (Aminco; или Enerpac, Inc., Butler, Wis.).

Клеточную суспензию загружают в цилиндрическую ячейку и помещают под гидравлический пресс. Поршень пресса опускается на поршень ячейки, пока не разовьется максимальное усилие. До этого момента выпускной клапан закрыт, а затем его медленно открывают до тех пор, пока поршень не пойдет медленно вниз. 
Перед разрушением клетки собирают, отмывают один раз и суспендируют в объеме буфера [0,01 м HEPES (М-2-гидроксиэтилпиперазин-М'-2-этансульфоновая кислота), pH 7,4 при 0°С], составляющем 0,1 объема взятой культуры. Добавляют немного панкреатической рибонуклеазы и дезоксирибонуклеазы (0,1 мг/мл) и разрушают суспензию на прессе Френча под давлением 14-107 Па. После разрушения добавляют MgCl2 до конечной концентрации 1 мМ и удаляют неразрушившиеся клетки центрифугированием при 5000 g в течение 5 мин. Mg2+ нужен для того, чтобы функционировала дезоксирибонуклеаза; его добавляют после разрушения, чтобы предотвратить стабилизацию рибосом.