Автор работы: Пользователь скрыл имя, 15 Января 2015 в 17:44, курсовая работа
Для получения метаболита, не накапливающегося в среде в обычных условиях в заметных количествах, часто требуются особые приемы радикального воздействия на клетки. Сущность этих приемов заключается в «дезорганизации» нормально функционирующих систем клетки с целью вычленения их отдельных участков. Одним из способов такой дезорганизации является повреждение в той или иной степени клеток микроорганизмов, от простого высушивания до глубокой дезинтеграции клеточных структур.
Введение
3
1. Структура клетки
4
1.1 Устройство и функции клеточной мембраны
9
2. Понятие дезинтеграции клеток и её цели
11
3. Методы дезинтеграции
12
3.1 Физические методы
12
3.2 Химические методы
17
3.3 Химико-ферментативные методы
18
Заключение
20
Список литературы
Осмотический шок – это повреждение или распад клеток, вызванные помещением их в гипотоническую или гипертоническую среду. Применяется для дезинтеграции клеток, имеющих малопрочную и высокопроницаемую клеточную оболочку. При этом происходит солевой шок, оболочка клеток, органелл, вирусов разрывается давлением воды, проникающей внутрь клетки. Клетки суспендируют в буферной гипертонической среде, содержащей ЭДТА, затем быстро переносят в охлажденную гипотоническую среду (на льду), центрифугируют, надосадок сливают. ЭДТА добавляют с целью разрушить липополисахариды клеточной стенки. Осмотический шок у некоторых бактерий наступает при переносе теплой культуры в холодный разбавитель.
Для непрерывной дезинтеграции микроорганизмов предложены способы, основанные на принципе декомпрессионной дезинтеграции. Сущность способа состоит в том, что клетки микроорганизмов предварительно насыщают газом под давлением до выравнивания парциального давления с обеих сторон оболочечного барьера, а затем переводят клетки в зону нормального давления. В результате возникает градиент давления, направленный во внешнюю среду, что и приводит к разрушению клеточной оболочки.
3.2 Химические методы
Химические методы дезинтеграции основаны на разрушении клеточной оболочки под воздействием щелочей, кислот, детергентов, ингибиторов синтеза оболочки клетки.
Разрушение клеточных стенок таким методом включают обработку щелочью, органическими растворителями или детергентами. Если белковый продукт не разрушается при pH от 10,5 до 12,5, то можно без труда и дешево лизировать большие количества бактериальных клеток. Например, рекомбинантный гормон роста человека очень просто выделить из клеток E. coli обработкой гидроксидом натрия. После обработки щелочью не остается практически ни одной жизнеспособной клетки, что автоматически решает проблему утечки рекомбинантных микроорганизмов. Обработка органическими растворителями - это простой и недорогой способ разрушения клеток, который используется для выделения ферментов из дрожжей. Однако, чтобы убедиться в том, что в подобранных условиях белковый продукт не денатурирует, необходимо провести предварительное тестирование. Под действием детергентов в мембранах бактериальных клеток образуются поры, через которые белки и другие молекулы выходят из клетки. Недостатком детергентов является их дороговизна, в большинстве случаев в их присутствии белки денатурируют, а кроме того, они могут загрязнять конечный продукт
3.3 Химико-ферментативные методы
К химико-ферментативным методам относятся использование антибиотиков, ферментов, ионогенные ПАВы.
1) Эффективный лизис клеток вызывают антибиотики полимиксины, тироцидины, новобиоцин, нистатин и другие, некоторые поверхностно-активные вещества, а также глицин.
Можно использовать автолиз клеток при лимитированном по определенному субстрату росте или их лизис при заражении бактериофагами. Последний вариант сопряжен с риском неконтролируемого распространения фага в промышленных установках и поэтому не получил применения.
При относительно низких концентрациях пенициллина подавляется активность эндопептидазы, что приводит к образованию поперечных перегородок в клетках, деление последних подавляется, происходит их удлинение и образование нитеобразных форм. Под воздействием более высоких концентраций пенициллина подавляется активность и другого фермента — гликозидазы, образование нитеобразных форм прекращается, синтез клеточной стенки полностью блокируется. При одновременном воздействии антибиотика на оба энзима происходит образование сферопластов, что приводит к классическому бактерицидному эффекту бензил-пенициллина.
Действие цефалексина и ампициллина на микробную клетку связано с подавлением эндопептидазы и проявляется в образовании удлиненных форм. Амоксициллин приводит к быстрому образованию сферопластов и лизису микробных клеток, что в целом определяет его быстрый бактерицидный эффект. Амидинопенициллины (в частности, мецииллинам) отличаются по механизму действия от других природных и полусинтетических пенициллинов: бактериальные клетки под их влиянием приобретают форму больших сферических образований. Этот эффект условлен не воздействием на энзимы клеточной стенки, а связан со специфическим белком, который определяет форму бактериальной клетки.
Антибиотики группы ванкомицина быстро и необратимо связываются с клеточной стенкой чувствительных бактерий, тем самым подавляя синтез клеточной стенки. Ванкомицин в отличие от пенициллина образует комплекс с ацил-D-аланил-D-аланином мукопептида клеточной стенки, другим отличием от действия беталактамов является подавление образования сферопластов за счет воздействия на цитоплазматическую мембрану. Иные молекулярные мишени действия ванкомицина в сравнении с пенициллинами и цефалоспоринами обусловливают его активность в отношении так называемых метициллиноустойчивых стафилококков.
Полимиксины повреждают цитоплазматическую мембрану чувствительных бактериальных клеток и необратимо связываются с ней. Молекулы полимиксинов реагируют с анионным фосфолипидным слоем мембраны. Наступающее при этом нарушение осмотических барьеров клетки приводит к выходу из нее внутриклеточных компонентов и к ее лизису. Токсичность полимиксинов также обусловлена их связыванием с мембранами животных клеток.
Полимиксины как катионные детергенты способны разрушать поверхностные структуры грамотрицательных бактерий, проникать внутрь клеток и взаимодействовать с нуклеиновыми кислотами и рибосомами. Двухвалентные ионы Са++ и Mg++ являются антагонистами бактерицидного эффекта полимиксинов. Снижение активности полимиксинов в присутствии физиологических концентраций двухвалентных катионов (в особенности кальция) объясняет иногда наблюдаемые несоответствия между высокой активностью антибиотика при определении чувствительности и его эффективностью в клинике.
2) Еще один наиболее распространенный метод разрушения клеток микроорганизмов - лизис с помощью ферментов.
Так, лизоцим яичного белка легко гидролизует клеточные стенки грамположительных бактерий. Для разрушения клеток грамотрицательных бактерий используют лизоцим и ЭДТА. Клеточные стенки дрожжей и плесневых грибов гидролизуют одним или несколькими ферментами: фосфоманназой, 1,3- и 1,6-глюканазой, хитиназой - или комплексным дрожжелитическим препаратом. Ферментативная обработка высокоспецифична, а лизис происходит в мягких условиях.
Автолизины (ферменты, расщепляющие клеточную стенку) существуют в клетке в латентной и активной форме. Активная возникает в результате процессингового протеолиза. В латентной форме автолизины рассеяны в области ЦПМ, активируясь, они приобретают сродство к субстрату и перемещаются в материал клеточной стенки. У клеток бактерий местом локализации активных форм автолизинов является район образования септы, у дрожжей - почки, у апикально растущих микроорганизмов - конец гифы. Именно поэтому при индукции автолиза первичные повреждения клеточных стенок наблюдаются в местах образования перегородок, перетяжек. Автолизины в активной форме перемещаются от одного участка клеточной стенки к другому в продольном (от ЦПМ наружу) и поперечном (от экватора к полюсам) направлениях, невидимому, вследствие образования новых слоев и наращивания новых поперечных участков в местах деления клетки.
Заключение
Физические способы разрушения более экономичны, чем химические и химико-ферментативные. Они осуществляются без применения дорогостоящих и дефицитных реактивов и ферментных препаратов. В то же время этим способам дезинтеграции клеток присуща определенная неизбирательность: обработка может отрицательно влиять на качество получаемого продукта.
Осторожное и избирательное разрушение клеточной стенки возможно при использовании химических и химико-ферментативных методов.
Самым мягким из всех механических способов разрушения клеток является разрушение клеточной мембраны под действием осмотического давления. Для большинства бактерий этот метод неприменим, если не обрабатывать предварительно клеточные стенки ферментами или не изменять их структуру другими способами.
Ультразвуковая обработка - наиболее быстрый и легкий способ разрушения клеток. Еще одно его достоинство заключается в том, что с его помощью эффективно разрушаются самые различные бактерии. Все это позволяет широко применять этот способ в бактериологических исследованиях.
В общем, наиболее распространенные физические методы разрушения клеток можно классифицировать следующим образом в порядке уменьшения их дезинтегрирующего действия: пресс Френча > вибрационные мельницы > пресс Френча > ультразвук > растирание с окисью алюминия. По устойчивости к разрушению клетки различных микроорганизмов можно расположить в последовательности (в порядке уменьшения): дрожжи >мицелий грибов > грамположительные кокки > грамположительные палочки > грамотрицательные палочки.
Список литературы