Питательные среды, Культивирование микро- организмов

          Министерство образования и науки РК

 Казахстанско-Российский медицинский  университет

 

 

 

           

                  СРС НА ТЕМУ:

        Питательные  среды,                      Культивирование микро-

организмов

 

 

                                                                                    

                               

                              

 

                              Алматы,2013 г.

 

Оглавление

   1. Введение

   2. История развития питательных  сред

   3. Культивирование микроорганизмов

   4. Классификация питательных  сред

   5. Дифференциально-диагностические  питательные среды

   6. Сухие питательные среды

   7. Плотные питательные среды

   8. Посуда

   9. Способы получения питательных  сред

    Вывод

  Список использованной литературы

 

1. Введение.

Микробы, как любые другие живые  организмы свое развитие и рост, обновление строительного материала, обеспечение энергетических процессов  осуществляют за счёт постоянного обмена веществ   с окружающей его  внешней средой, т.е. путём питания  и дыхания. В зависимости от типа питания микробы подразделяют на аутотрофы (способные усваивать углерод из СО2, а также молекулярный азот из  воздуха, а минеральные вещества путём хемо- или фотосинтеза) и гетеротрофы (способны усваивать углерод и другие вещества только из готовых органических соединений). К аутотрофам относятся в основном многие почвенные бактерии, к гетеротрофам (параторофам) – микробы инфекционных болезней животных и растений. 

Типы питания, дыхания (аэробы и  анаэробы), индукцию и активность ферментов, токсинов, пигментов, рост и размножение  являются основными физиологическими параметрами, которые учитывают  при разработке составов питательных  сред и условий культивирования  микробов in vitro.

 

-------------------------------------------------

2. История развития питательных  сред

В эмпирический («допастеровский») период в качестве питательных сред использовались только настои и отвары. Л. Пастер и К. Негели ввели в практику культивирования микробов безбелковые среды. Р. Кох и Ф. Леффлер для выращивания микробов использовали мясную воду, пептон и хлористый натрий. Эта среда представляет собой мясо-пептонный бульон, из которого готовят мясо-пептонный агар путём добавления 1—2 % фабричного агара.

Благодаря способности агар-агара  придавать питательному продукту при  охлаждении консистенцию плотного студня, и высокой устойчивости к ферментативному  действию микробов он нашёл широкое  применение в бактериологической технике  при изготовлении питательных сред.

 

3. Культивирование микроорганизмов.

Культивировать микроорганизмы –  это значит искусственно создавать  условия для их роста и размножения  in vitro, взаимосвязанных, но не обязательно сопряжённых процесса. Рост и размножение –циклический 4-х фазный  процесс (латентная, логарифмического роста, стационарная, гибель). Период между образованием новых клеток и их делением называется периодом генерации, на длительность которого, кроме особенностей микроба, влияет состав питательной среды. Формы колоний разных микробов на питательной среде одного и того же состава отличаются, что учитывают при их дифференциации.

Для культивирования  in vitro  необходимы субстраты, которые микроорганизмы могут использовать  в качестве питательных веществ для своего роста и размножения. Такие питательные субстраты – плотные или жидкие – называют культуральными или питательным средами. В большинстве случаев в микробиологических лабораториях микроорганизмы культивируют in vitro, т.е. в стеклянных колбах, пробирках и других сосудах.

К любой питательной среде предъявляют  ряд основных требований:

1). Стерильность и по возможности  прозрачность.

2). При составлении питательных  сред  учитывают потребность микроорганизмов  в элементах питания (необходимые  для жизнедеятельности клеток  биохимические факторы – источники  энергии, С, N, S, а также неорганические  ионы – доступные для усвоения  микроорганизмами).

3). Оптимальные значения ряда  биофизических показателей: концентрации  водородных ионов (pH), окислительно-восстановительного потенциала (Eh), активности воды (aw), осмотического давления.

 

4. Классификация питательных сред.

В зависимости от видовой принадлежности микробов и целей культивирования  консистенция и составы культуральных сред бывают разными и варьируют в широких пределах. Среда, отвечающая биологическим особенностям микроба и обеспечивающая его рост и размножение, называется полноценной, не имеющая какого- либо компонента, необходимого для его жизнедеятельности – дефицитной.

Питательные среды классифицируют в зависимости от:

   * химического состава и  исходных компонентов;

   * консистенции;

   *  целевого назначения.

В зависимости от химического состава  и исходных компонентов различают  следующие типы питательных сред:

- среды неопределенного химического  состава (естественные или натуральные  среды) – это среды, которые  состоят из продуктов животного  или растительного происхождения,  имеющие сложный неопределенный  химических состав:

   1) среды животного происхождения  (исходные продукты – мясо, рыба, яйца, молоко и т.д.)

   2) среды растительного происхождения  (исходные продукты – соя, горох,  картофель, морковь и т.д.)

На естественных средах хорошо развиваются  микроорганизмы, однако эти среды  малопригодны для контролируемого  изучения физиологии обмена веществ  микроорганизмов и диагностических  исследований, поскольку они не позволяют учитывать потребности ряда компонентов среды, а с другой стороны определять вещества,  образующие  микроорганизмами. Естественные среды используют главным образом для поддержания культур микроорганизмов, накопления их биомассы и диагностических целей.

 «Полусинтетические» среды  (гидролизатные), относящиеся к средам с неопределенным составом. В них, наряду с соединениями известной химической природы, входят вещества неопределенного состава. Их используют в микробиологической практике для получения витаминов, антибиотиков, аминокислот и других продуктов жизнедеятельности микроорганизмов (продукты гидролиза мяса, молока, дрожжей, крови и др. белковых веществ).

Среды известного химического состава (синтетические) – в их состав включают известные химические соединения (соли, углеводы, аминокислоты, витамины и  т.д.) в оптимальном количественном соотношении. Синтетические среды  по составу бывают простыми или имеют  относительно большой набор компонентов. Их используют, когда выращиваемую клеточную массу необходимо максимально  освободить от балластных органических соединений, входящих в состав обычных  сред, например при получении диагностических  аллергенов или при изучении метаболических потребностей микроорганизма в том  или ином конкретном химическом соединение. Кроме того, исследователи стремятся  определить для каждого микроорганизма минимальные потребности в питательных  веществах и, исходя из этого, создать  минимальную среду, содержащую лишь необходимы для его размножения  химические соединения.

По консистенции питательные среды  дифференцируют на плотные, полужидкие и жидкие.

Жидкие питательные среды. Готовят, используя экстракты, гидролизаты, растворы исходных продуктов.

Полужидкие и плотные питательные  среды. Используют для учёта количества бактерий, выделения их в виде «чистой» культуры и других целей.  Необходимую  консистенцию среде придают добавлением  различных уплотнителей - агар-агар или желатину.

 

Агар-агар (малайское желе)- растительный коллоид, получаемый из некоторых морских  водорослей. В его состав входят главным образом полисахариды с  ничтожным количеством азотистых веществ. Для получения плотных сред его добавляют в количестве 1,5-2%,полужидких –0,3-0,7%.

Желатина – кислый азотистосодержащий продукт, добываемый при выварке костей и хрящей. Обычно в питательные среды вносят 10-20% желатины. Но ряд бактерий выделяют протеолитические ферменты, разлагающие желатину, что делает его неудобным для применения.

По целевому назначению различают:

А).Общеупотребительные (основные) среды.

 Их применяют для культивирования  относительно неприхотливых   микроорганизмов.

 

5. Дифференциально-диагностические  питательные среды.

Дифференциально-диагностические  питательные среды используют для  определения видовой принадлежности исследуемого микроба, основываясь  на особенностях его обмена веществ. По своему назначению дифференциально-диагностические  питательные среды подразделяются следующим образом:

·       Среды для выявления протеолитической и гемолитической способности микробов, содержащие в своем составе белковые вещества: кровь, молоко, желатин, свернутую кровяную сыворотку и т. д.

·       Среды с индифферентными химическими веществами, которые служат источником питания для одних видов микробов и не усваиваются другими видами.

·       Среды с углеводами и многоатомными спиртами для обнаружения соответствующих ферментов.

·       Среды для определения редуцирующей способности микробов.

В состав дифференциально-диагностических  сред, предназначенных для выявления  сахаролитических и окислительно-восстановительных ферментов, вводят индикаторы: нейтральный красный, метиленовый синий, лакмусовую настойку, кислый фуксин, бромтимоловый синий, водный голубой краситель и розоловую кислоту. Изменяя свою окраску при различных значениях рН, индикатор указывает на наличие или отсутствие расщепления, окисления или восстановления введенного в среду ингредиента. Однако индикатор не является обязательной составной частью сред, предназначенных для выявления ферментов. Так, наличие желатиназы и других протеолитических ферментов в культуре определяют по разжижению желатина, свернутого яичного или сывороточного белка.

 

6. Сухие питательные среды.

В последние годы в бактериологии  широко пользуются сухими питательными средами. Это избавляет лаборатории  от громоздкого процесса приготовления  обычных сред, позволяет получать сравнимые результаты в разных лабораториях и, наконец, приближает к разрешению вопроса о стандартности питательных  сред. Значение сухих сред возрастает в экспедиционных и полевых условиях.

Сухие питательные среды следует  хранить герметически закрытыми  и по возможности не на свету, так  как препараты гигроскопичны  и светочувствительны. Увлажнение, комкование и изменение цвета порошка свидетельствуют о понижении качества препарата. Сухие препараты, не содержащие глюкозы, даже при комковании могут не терять своих качеств, однако их пригодность следует проверить. При наличии же в сухой среде глюкозы комкование и изменение цвета порошка свидетельствуют о порче.

Технология приготовления питательных  сред из сухих препаратов проста. Навеску, указанную на этикетке, всыпают в  стеклянную колбу или бутыль с  холодной дистиллированной водой. Смесь  следует хорошо размешать до полного  смачивания порошка водой. Затем  в водяной бане или лучше в  текучепаровом аппарате смесь нагревают  до кипения, периодически помешивая. Кипятят  до тех пор, пока порошок окончательно не растворится. Растворение на голом  огне возможно, но требует большого внимания, чтобы не допустить пригорания среды. Перед разливкой следует  среду хорошо перемешать. Сухие среды  выпускаются основные, элективные и  дифференциальные.

Сухой питательный агар (рН 7,3—7,6).

К растворенному сухому агару (5—7,5 г сухого агара на 100 мл) рекомендуется добавлять в качестве факторов роста небольшое количество дрожжевого аутолизата, мясной воды или неразведенного триптического перевара мяса (около 1/3 растворяющей жидкости). Для выявления валообразования паратифозной В палочки, а также расщепления бактерий Зонне на круглые  и плоские варианты сухой агар растворяют дистиллированной водой, содержащей триптический перевар, в отношении 2:1. Если после растворения агар недостаточно прозрачен, его фильтруют через ватно-марлевый фильтр. Разливают по пробиркам или флаконам. Стерилизуют под давлением  1  атм. в течение 20 минут.

 

7. Плотные питательные среды

Питательные свойства плотной среды  зависят исключительно от состава  питательного бульона, из которого она  изготовлена путем добавления агар-агара  или желатины. Последние служат как  желирующие вещества для создания плотности среды.

К мясопептонному бульону или бульону  Хоттингера 1 (рН 8,2—8,4) добавляют 2—2,5% отечественного или 2% импортного мелко нарезанного агар-агара. К дрожжевому аутолизату необходимо добавить и 0,5% поваренной соли. Концентрация агара в большой степени зависит от качества агар-агара. Поэтому при употреблении новой партии агара необходимо проверить его желирующую способность. Если агар влажный, его следует до употребления подсушить.

Кастрюлю с бульоном и агаром ставят на огонь и кипятят до полного растворения агара. Во время кипячения необходимо все время помешивать во избежание пригорания. По окончании кипячения следует восстановить объем среды добавлением горячей дистиллированной воды. Проверяют и, если нужно, исправляют реакцию. При определении реакции в агаре или желатине температура этих сред должна быть не ниже 80°, так же как и температура воды, прибавляемой в пробирки компаратора. В противном случае агар или желатина очень быстро становятся плотными, что затрудняет определение. После установления реакции агар кипятят. Дают ему отстояться в теплом месте, после чего фильтруют в горячем состоянии через ватно-марлевый фильтр. Осадок на фильтр не выливают. Разливают в посуду, стерилизуют под давлением 1 атм. в течение 30 минут.